1、技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种维立西呱的关键杂质和其制备方法。
2、背景技术
维立西呱(Vericiguat)是拜耳和默沙东联合开发的首个可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)刺激剂，用于治疗慢性心力衰竭和冠状动脉疾病。2021年1月19日，维立西呱片在美国获批上市。2021年6～7月，在日本及欧盟相继获批上市。2020年8月，拜耳在中国提交了维立西呱片的上市申请，同年10月，按“临床急需的短缺药品、防治重大传染病和罕见病等疾病的创新药和改良型新药”正式纳入优先审评，2022年5月获NMPA批准进口上市。
维立西呱化学名为(4,6-二氨基-2-(5-氟-1-(2-氟苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)嘧啶-5-基)氨基甲酸甲酯，CAS号为1350653-20-1，具体结构如下所示：
杂质研究作为原料药工艺开发的一项重要研究内容，直接关系到药物的质量控制以及安全性，通过鉴定药物产品中的杂质结构，可以明确该杂质的毒性及准确确定产品中杂质的量，也可确定该杂质的产生的来源，从而制定有效的控制策略，将其在API中残留量控制在符合药用的限度(0.1％或更低)以下，进而有助于加强对产品质量和安全性的控制。
本发明人对维立西呱制备工艺中系列研究中发现维立西呱有一个未知关键杂质，其在原料和片剂中均有检出，据现有报道的制备路线中，该杂质均不可避免，但现有文献中均未见该杂质的相关报道。本发明人发现该杂质化合物对维立西呱的质量有较大影响，需要识别和制备出进而用于维立西呱的纯度、杂质和定量分析，以有效控制产品质量，进一步提高维立西呱质量控制的水平和安全性。
3、发明内容
本发明提供了一种维立西呱的关键杂质式(I)化合物，以及一种操作简单、高效且满足对照品要求的式(I)化合物的制备方法和一种准确度灵敏性更高的式(I)化合物的高效液相色谱测定方法，以满足药物质量控制的需要。
本发明提供了一种维立西呱杂质，如下式(I)所示。
维立西呱分子结构中，三氨基嘧啶片段上氨基的羰基化是一个关键步骤。已报导的制备方法采用氯甲酸甲酯，焦碳酸二甲酯等进行羰基化反应。这一类羰基化试剂具有较高的活性，副反应难以避免。
该杂质既是工艺杂质也是降解杂质。式(I)化合物在维立西呱原料和制剂生产中均需控制，是质量控制以及稳定性实验中均为必备对照品，且需求量大。是确定药品质量、有效期及货架期，保证上市药品质量的关键杂质之一。本发明人在制备维立西呱的过程中发现，提高羰基化试剂的用量或延长反应时间，式(I)化合物的生成量会有所提高。初期采用维立西呱的制备路线，经过调整投料比和延长反应时间，获得含量大约1％的式(I)化合物的反应体系，经过柱分离或制备液相分离得到。由于维立西呱分子结构性质，该方法提高式(I)化合物含量也会同时提高其他多个杂质的含量，且提高比例远高于目标化合物，给分离纯化带来极大不便，同时带来更多的溶剂消耗和环保压力。
为了提高式(I)化合物的制备效率及质量，满足维立西呱质量研究与控制的需求，本发明人采用逆向合成法，设计并建立了一种简单有效的制备方法。
本发明提供了一种式(I)化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将维立西呱加入溶剂(a)中搅拌溶解，加入碱和甲基化试剂，搅拌反应，薄层色谱跟踪反应完成，加入溶剂(b)，降温析出固体，过滤得到式(I)化合物粗品；
(2)式(I)化合物粗品经过硅胶色谱柱层析纯化得到式(Ⅰ)化合物固体。
其中，
步骤(1)中溶剂(a)为极性溶剂，选自水、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、二氧六环、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、丁酮、环丁砜中的一种或几种；溶剂(b)为中低极性溶剂，选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、甲酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、氯苯、苯甲醚、甲基叔丁基醚中的一种或几种；溶剂(b)加入量是溶剂(a)体积的5～10倍；碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、碳酸铯、碳酸锂、三乙胺、二异丙基乙胺、三甲胺中的一种或几种；甲基化试剂选自甲醛、多聚甲醛、二氯甲烷、二溴甲烷、重氮甲烷中的一种或几种；搅拌范围温度为20℃～100℃，优选60℃～90℃；步骤(2)中硅胶色谱柱纯化所用洗脱剂为甲醇与二氯甲烷，两者的体积比1:30～10:1。
本发明人研究过程中同时发现已报道的检测方法在精密度、专属性以及检测效率等方面对式(I)化合物在维立西呱原料和制剂中含量的检测存在不足，有较大的检测偏差风险。本发明人针对质检缺陷，开发了新的高效液相分析方法，可以提高维立西呱有关物质检测的准确性和灵敏性，极大降低上市药品的质量风险。
本发明进一步提供了一种维立西呱及其关键杂质式(I)化合物的高效液相色谱测定方法，色谱条件包括：
色谱柱：五氟苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选Agilent Poroshell 120PFP，4.6mm×150mm，2.7μm，或效能相当的其他色谱柱；
流动相：流动相A：磷酸氢二钾/磷酸溶液，浓度为0.5～25mmol/L，优选10mmol/L，pH范围为5.0-6.8，优选pH＝6.0；流动相B：乙腈；
检测波长：250-270nm，优选268nm；
流速为0.5-1.5mL/min，优选0.8mL/min；
洗脱程序：流动相A和流动相B按以下梯度运行：
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了维立西呱一种关键杂质，确证了其结构，并提供了该关键杂质的简单、高效的制备方法，制备所得产品满足杂质对照品要求；
(2)研发人员可根据其结构明确其产生来源及产生的影响因素，并在生产工艺中制定合理的控制策略，确保产品质量及安全有效；
(3)本发明提供了一种准确度、灵敏度及专属性高的检测维立西呱中关键杂质式(I)化合物残留量的质量控制方法，可以准确检测与控制维立西呱中关键杂质(I)化合物的残留量。可以较好的满足维立西呱质量研究与控制对关键杂质对照品式(I)化合物数量与质量的需求；实现对产品中该杂质残留量准确定量研究，从而确定合理的内控标准及货架期标准，确保产品安全有效。
4.附图说明：
图1为实施例1制备所得的式(I)化合物的高分辨质谱图。
图2为实施例1制备所得的式(I)化合物的高效液相纯度图谱。
图3为实施例1制备所得的式(I)化合物的核磁共振氢谱图。
图4为实施例4中维立西呱样品高效液相色谱检测图谱。
图5为实施例4中市售维立西呱片高效液相色谱检测图谱。
5.具体实施方式：
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1式(I)化合物的制备
室温条件下，维立西呱5.0克(11.7mmol)加入25毫升二甲基亚砜中搅拌溶清。加入1.6克(11.7mmol)碳酸钾和10毫升福尔马林搅拌10分钟后升温至60℃反应约4小时，TLC监测反应完全(展开剂为二氯甲烷：甲醇＝7：1)。降温至室温，加入200毫升乙酸异丙酯，继续降温至0℃搅拌析晶1小时。过滤得到粗品黄色固体5.3克(湿品)。粗品经过硅胶色谱柱纯化，用二氯甲烷：甲醇＝30：1至1：1梯度洗脱，收集目标化合物洗脱液，减压浓缩至干得到类白色固体3.2克，纯度：95.6％，收率62.2％。
1HNMR(600MHz，DMSO-d6)：δ3.30-3.33(6H，d,J＝22Hz),δ5.24-5.26(1H，t,J＝5.4Hz)，δ5.82(2H，s)，δ6.32(2H，br)，δ6.85(1H，br)，δ7.12-7.13(2H，m),δ7.22-7.25(1H，t,J＝9Hz)，δ7.34-7.37(1H，m)，δ7.76(1H，br)，δ8.06(1H，br)，δ8.62(1H，s)，δ8.67-8.69(1H，dd，J＝9)。
高分辨质谱：检测值：865.2806；理论值：Exact Mass:865.2801，Formula:C39H33O4F4N16+。
实施例2式(I)化合物的制备
室温条件下，维立西呱3.5克(8.21mmol)加入20毫升甲醇中搅拌溶清。加入1.2克(8.3mmol)碳酸钾和1.0克多聚甲醛搅拌10分钟后升温至回流反应约5小时，TLC监测反应完全。降温至室温，加入100毫升乙酸乙酯，降温至0℃搅拌析晶1小时。过滤得到粗品黄色固体3.0克。粗品经过硅胶色谱柱纯化，用二氯甲烷：甲醇＝30：1至1：1梯度洗脱，收集目标化合物洗脱液，减压浓缩至干得到类白色固体0.8克，纯度96.2％，收率22.2％。
实施例3式(I)化合物的分离检测
供试品溶液的制备：取维立西呱原料或市售维立西呱片供试品适量，加20％终体积的二甲基亚砜使溶解，用溶剂稀释制成每1ml中约含0.4mg供试品的溶液。
对照溶液的制备：精密量取维立西呱原料或市售维立西呱片供试品溶液适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含0.4μg供试品的溶液。
系统适用性溶液的制备：取式(I)化合物对照品适量，加20％终体积的二甲基亚砜使溶解，用溶剂稀释制成每1ml中约含0.4mg式(I)化合物的溶液。
灵敏度溶液的制备：精密量取对照溶液适量，用溶剂定量稀释制成每1ml中约含0.2μg供试品的溶液。
色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120PFP，4.6mm×150mm，2.7μm；
流动相：流动相A：10mmol/L的磷酸氢二钾/磷酸溶液，pH＝6.0；流动相B：乙腈；
检测波长：268nm；
流速：0.8mL/min；
洗脱程序：流动相A和流动相B按以下梯度运行：
精密量取供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如显杂质峰，照系统适用性溶液结果进行归属，按主成分自身对照法计算，式(I)化合物(相对保留时间约为1.5)的峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.1％)。系统适用性溶液色谱图中，理论板数按式(I)化合物峰计算不低于8000。灵敏度溶液色谱图中，维立西呱峰高的信噪比应不小于10。
测得维立西呱原料及市售维立西呱片中杂质(I)化合物中含量测定结果见下表1：
表1式(I)化合物含量
实施例4线性试验
杂质式(I)化合物贮备液的制备：称取杂质式(I)化合物对照品约5mg，精密称定，置20ml量瓶中，加二甲基亚砜使溶解并稀释至刻度，摇匀。
维立西呱贮备液的制备：称取维立西呱对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加二甲基亚砜10ml使溶解，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
线性贮备液的制备：精密量取杂质式(I)化合物贮备液与维立西呱贮备液各1ml，置同一50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限溶液的制备：精密量取线性贮备液0.25ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。
精密量取线性贮备液0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml，分别置于5个10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性1～线性5溶液。
精密量取定量限溶液与线性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；结合定量限结果，以峰面积对浓度作曲线，按最小二乘法计算回归方程、相关系数及截距，结果见下表3。
表2线性实验结果
由线性试验所得回归方程的斜率，计算得到杂质的校正因子(主成分的斜率/杂质的斜率)，结果见下表3。
表3杂质式(I)化合物的校正因子