技术领域
本发明属于分子生物合成技术领域，涉及一种高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法。
背景技术
滨蒿内酯(scoparone)是一种著名的香豆素类化合物，一种可再生植物来源的天然生物资源，最早从中草药茵陈蒿(Artemisia capillaris Thunb.)中分离得到，作为茵陈蒿的主要提取物受到了许多研究者的关注。滨蒿内酯具有广泛的药理作用，例如抗肿瘤、保肝和利胆、抗哮喘、抗过敏和抗炎等一系列作用和功效。此外，滨蒿内酯在农业领域也扮演着越来越重要的作用，大量研究表明，滨蒿内酯对植食性害螨具有高选择性毒性，而对天敌等近乎无毒，而且还具有杀虫、杀菌等活性。2018年滨蒿内酯取得“二甲氧香酯”(农标字2018第003号，国家农药标准化技术委员会)的农药学名。这些研究充分表明滨蒿内酯具有开发成新一代植物源农药的价值和潜力。
目前滨蒿内酯的获取方法主要分为两种。第一种是从植物茵陈中直接提取，然而该种方法受到植物资源的限制而且提取工艺复杂、产率低、污染严重。第二种是通过化学合成的方式，DuH SB和Parihar以对羟基苯酚为原料，与乙酸酐发生反应，生产1,2,4-苯三酚三乙酯，再通过与2-羟基丁酯发生环化反应，生成秦皮乙素，秦皮乙素再甲基化得到滨蒿内酯；张树芬等利用苯醌与乙酸酐反应生成1,2,4-苯三酚三乙酯，然后与苹果酸环化得到秦皮乙素，再甲基化得到滨蒿内酯。目前现有的滨蒿内酯制备方法，主要还是利用传统的制备方法，存在生产工艺步骤较多、毒性大与污染严重等缺点。这些因素严重限制了滨蒿内酯的高效、绿色规模化生产，阻碍了其进一步开发和利用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种O-甲基转移酶基因序列，该序列可在宿主细胞中表达高活性O-甲基转移酶，并且可以以东莨菪内酯为底物，催化得到滨蒿内酯。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.一种高活性O-甲基转移酶基因，所述O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.一种高活性O-甲基转移酶，所述O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种重组表达载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的O-甲基转移酶基因。
4.一种重组菌，所述重组菌含有上述的重组表达载体，或在基因组上整合了SEQID NO.2所示的基因。
5.上述O-甲基转移酶基因、上述O-甲基转移酶、上述重组表达载体或上述重组菌在制备滨蒿内酯中的应用。
上述O-甲基转移酶基因、上述重组表达载体或上述重组菌都可以利用生物工程制备得到O-甲基转移酶蛋白，其具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，该酶具有O-甲基转移酶催化功能，可以催化东莨菪内酯合成滨蒿内酯。
6.还提供一种高活性O-甲基转移酶的制备方法，包括以下步骤：
1)、将权利要求1所述的基因构建到载体中；再转化到宿主菌株中，得到重组表达菌株；
2)、将步骤1)重组表达菌株在TB液体培养基中培养，并加入IPTG诱导，发酵完毕，获得可溶性重组的O-甲基转移酶蛋白。
7.还提供一种高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法，所述方法为：上述O-甲基转移酶基因、上述重组表达载体或上述重组菌利用生物工程制备得到O-甲基转移酶蛋白，再以东莨菪内酯为底物，催化得到滨蒿内酯。
进一步，高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法中，包括2种具体的方法，其中具体的方法1为：将构建有SEQ ID NO.2所示基因的重组菌接种于TB液体培养基中培养，并加入IPTG诱导，诱导表达4h后，分阶段向培养基中添加东莨菪内酯，培养至发酵结束，上清液含有催化后的滨蒿内酯；
或者，具体的方法2为：将构建有SEQ ID NO.2所示基因的重组菌接种于TB液体培养基中培养，并加入IPTG诱导，培养至发酵结束；取菌株细胞体进行高压均质破碎，破碎后收集裂解液的上清液，得到含有OMTSyn蛋白的粗酶液；将OMTSyn蛋白、S-腺苷-L-甲硫氨酸和东莨菪内酯一起30℃反应1小时以上，得滨蒿内酯。
其中反应体系中按1mg的6’-O-甲基转移酶与500μM的底物东莨菪内酯添加。
进一步，高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法中，重组菌接种于TB液体培养基中培养时在35～40℃培养至OD600为0.6～0.8；添加东莨菪内酯后培养温度为28-30℃。
进一步，高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法中，具体的方法2中，OMTSyn蛋白为含有OMTSyn蛋白的粗酶液，或者含有OMTSyn蛋白的粗酶液进一步纯化得到的OMTSyn蛋白。
进一步，高活性O-甲基转移酶基因制备滨蒿内酯的方法中，构建有SEQ ID NO.2所示基因的重组菌的具体制备方法为：用引物分别扩增SEQ ID NO.2所示的基因和空载体质粒，再DNA回收试剂盒回收目标片段，通过同源重组的方法整合在空载体质粒的EcoRI/NotI位置，获得重组质粒；再将重组质粒转化到宿主菌株中，得到重组表达菌株。
扩增SEQ ID NO.2所示的基因的引物序列为：
P1：gatctggaagttctgttccaggggcccctgggatccccggatgaccaccaccgaactgat；
P2：accgaaacgcgcgaggcagatcgtcagtcagtcacgatgcttatttcagaaattccataatccaggtattgtgcg。
优选的，空载体质粒为pGEX-6p-1。
优选的，宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种人工设计的O-甲基转移酶和表达该酶的人工基因序列，可基因重组进行人工表达高活性O-甲基转移酶，还提供了其催化东莨菪内酯生产滨蒿内酯的新用途，该酶可以O-甲基转移酶催化东莨菪内酯使其在6’位添加一个甲基，获得滨蒿内酯，该制备方法简单，高效，安全无毒，可高效、绿色规模化生产滨蒿内酯，扩大滨蒿内酯的在医药或杀虫剂中应用范围，提高其应用价值。可简单的在表达该基因的重组大肠杆菌诱导表达时直接添加底物，用于生产滨蒿内酯，可在72h内催化300mg/L的东莨菪内酯生成50.5mg/L的滨蒿内酯，摩尔转化率为15.7％。也可以使用纯化后的酶蛋白，加入S-腺苷-L-甲硫氨酸和东莨菪内酯进行体外合成滨蒿内酯，进一步证明了人工酶OMTSyn具有6’-O-甲基转移酶催化功能，且具有高达92.6％的转化率。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为东莨菪内酯经过OMTSyn催化产滨蒿内酯示意图。
图2为pGEX-6p-1/OMTsyn菌液PCR鉴定电泳图(其中泳道1-6和8为重组菌菌检结果，7为阳性对照)。
图3为pGEX-6p-1/OMTsyn的酶切鉴定图。
图4为实施例3的大肠杆菌yGJ88中OMTSyn以东莨菪内酯为底物的发酵液的高效液相检测结果。
图5为SEQ ID NO.1翻译表达OMT的蛋白纯化图，其中M为参照物，1为原始大肠杆菌总蛋白，2为带有重组表达载体的诱导后的大肠杆菌上清液蛋白，3为纯化的蛋白。
图6为pGEX-6p-1/OMT的酶切鉴定图。
图7为菌株yGJ87代谢物的HPLC检测图。
图8为OMTSyn的蛋白纯化图，其中M为参照物，1为原始大肠杆菌总蛋白，2为带有载体的诱导后的大肠杆菌总蛋白，3为带有重组表达载体的诱导后的大肠杆菌上清液蛋白，4为纯化的蛋白。
图9为酶法合成滨蒿内酯的HPLC检测图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
LB培养基：5g/L酵母粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠。根据需求添加终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素。
TB培养基：24g/L酵母粉、12g/L蛋白胨、4mL/L甘油。
固体培养基中添加20g/L的琼脂粉。
缓冲液A：20mM K2PO4,20mM KH2PO4,50mM NaCl，pH 7.4。
缓冲液B：20mM K2PO4,20mM KH2PO4,50mM NaCl，500mM GSH，pH 7.4。
PBS缓冲液：160mL的20mM NaH2PO4与840mL的20mM Na2HPO4混合(pH 7.5)。
检测方法：
样品使用安捷伦高效液相检测，C18反相色谱柱(4.6mm×250mm)，柱温25℃。流动相为甲醇(A)：0.1％甲酸水(B)＝40:60，流速1mL/min，进样量10μL，检测波长为343nm。东莨菪内酯表样在第7.9mim出峰，滨蒿内酯表样在第11.6min出峰。
甲基转移酶酶活性检测方法：取400μL蛋白溶液于1.5mL离心管，依次添加400μL溶解了5mM S-腺苷-L-甲硫氨酸的PBS溶液、200uL溶解了2.5mM东莨菪内酯的PBS溶液。吹打混匀后置于30℃水浴锅中反应1h。取800μL反应液于5mL离心管中，添加800μL乙酸乙酯，充分混合均匀后13400rpm离心5min取上清液用于液相检测。
发明对应的OMTSyn的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，相较于原始的氨基酸序列，优化后的序列发生了两处突出改变(D271A/N325A)。
表1菌株和质粒的基因型
实施例1：重组质粒的构建
(1)基于甲基转移酶的特性结合计算机辅助设计等技术并根据大肠杆菌密码子偏好性，人工设计后全基因合成OMTsyn基因，相较于原始的氨基酸序列，优化后的序列发生了两处突出改变(D271A/N325A)。原始核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示，人工设计后的序列如序列表SEQ ID NO.2中所示，对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3中所示。
使用引物P1/P2扩增SEQ ID NO.2，使用DNA回收试剂盒回收目标片段，再通过同源重组的方法连入线性化的表达载体pGEX-6p-1的EcoRI/NotI位置，获得重组质粒pGEX-6p-1/OMTsyn。
表2所有基因的碱基和氨基酸序列
表3引物序列
注：小写字母表示同源序列，用于同源重组。
实施例2：重组大肠杆菌的构建
通过大肠杆菌化学转化法，将实施例1构建的重组质粒pGEX-6p-1/OMTsyn转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化液涂布到含有50μg/mL的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养后，长出单菌落即为重组大肠杆菌，经过菌检、酶切和测序验证获得阳性菌株，并将测序正确的菌株命名为yGJ88。图2为pGEX-6p-1/OMTsyn菌液PCR鉴定电泳图(其中泳道1-6和8为重组菌菌检结果，7为阳性对照)。图3为pGEX-6p-1/OMTsyn的酶切鉴定图。
实施例3：重组大肠杆菌yGJ88生产滨蒿内酯
将实施例2构建的重组大肠杆菌yGJ88进行发酵验证，以东莨菪内酯为底物，检测有无底物消耗和新物质生成。
发酵条件如下：在250mL摇瓶中发酵条件：挑取至少10个单菌落接种在含有20mL的LB液体培养基的250mL摇瓶中，37℃，220rpm培养10-12h后，按照起始OD600为0.01转接到含有20mL新鲜的TB液体培养基的250mL摇瓶中，培养基中添加终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素，37℃，220rpm培养3-4h后，添加终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，同时将温度降低为30℃，诱导表达4h后，分别在12、24、36和48h时，向培养基中添加75mg/L的底物，共计添加300mg/L。30℃，220rpm培养72h后结束发酵。取500μL的发酵液于2mL的离心管中并添加等体积的甲醇，震荡混匀后，13500rpm离心5min，取上清液，过0.22μm的尼龙膜后，备用，用于液相检测。液相结果证明，OMTsyn有催化东莨菪内酯合成滨蒿内酯的能力，图1为东莨菪内酯经过OMTSyn催化产滨蒿内酯示意图。经过72h发酵后，可以催化300mg/L的东莨菪内酯，获得50.5mg/L的滨蒿内酯。图4为本实施例的大肠杆菌yGJ88中OMTSyn以东莨菪内酯为底物的发酵液的高效液相检测结果。
利用已经公布的转录组数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接到克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。将上述甲基转移酶基因序列用EcoRI和NotI双酶切，并连接到同样经EcoRI和NotI双酶切的pGEX-6p-1表达载体。重组载体pGEX-6p-1/OMT按照细菌转化方法进行转入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取筛选得到的阳性转化子并命名为yGJ87，严格按照实施例3诱导重组子进行表达并转化300mg/L的东莨菪内酯，发酵结束后，取样，液相检测。经过72h发酵后，液相结果表明，几乎检测不到东莨菪内酯的含量变化，图5为SEQ ID NO.1翻译表达OMT的蛋白纯化图，其中M为参照物，1为原始大肠杆菌总蛋白，2为带有重组表达载体的诱导后的大肠杆菌上清液蛋白，3为纯化的蛋白。图6为pGEX-6p-1/OMT的酶切鉴定图，图7为菌株yGJ87代谢物的HPLC检测图。结果说明，只有本发明提供的根据甲基转移酶序列特点改造的并经过大肠杆菌密码子偏好性合成的DNA序列表SEQ ID NO.2所示的序列才能实现目标蛋白的高效功能性表达，并实现对东莨菪内酯C6位羟基的甲基化反应。
实施例4：OMTsyn酶法合成滨蒿内酯
OMTSyn的蛋白纯化：将实施例3中的诱导表达后的菌株收获，4℃，5000rpm离心10min后去除上清液，沉淀使用50mL PBS缓冲液重悬2次后，4℃，5000rpm离心10min后去除上清液。沉淀使用50mL的PBS重悬后加入已经预冷到4℃的高压均质机中。将高压均质机调节为850bar，开机并破碎2次后收集裂解液。裂解液4℃，13400rpm离心10min保留上清液，上清液过0.45μm的滤膜备用，过滤液即为含有OMTSyn蛋白的粗酶液。
图8为本实施例中OMTSyn的蛋白纯化电泳图，其中M为参照物，1为原始大肠杆菌上清液，2为带有载体pGEX-6p-1的诱导后的大肠杆菌上清液，3为带有重组表达载体pGEX-6p-1/OMTSyn的诱导后的大肠杆菌上清液，4为纯化的蛋白。
将实施使用亲和层析法回收OMTsyn蛋白质。使用缓冲液A平衡1mL镍柱，然后以1mL/min流速上粗酶液，以1mL/min流速冲洗10个镍柱体积的缓冲液A，随后以1mL/min流速使用缓冲液B冲洗镍柱，根据UV值收集洗脱峰。将收集到的洗脱峰使用脱盐柱(HitrapDesalting，5mL)进行脱盐处理，用pH 7.5的PBS以5mL/min的流速洗脱回收目标蛋白。使用NanoDrop对回收的目标蛋白进行定量，并用pH 7.5的PBS稀释到蛋白浓度为2.5mg/mL，置于4℃冰上备用。
取400μL蛋白溶液于1.5mL离心管，依次添加400μL溶解了5mM S-腺苷-L-甲硫氨酸的PBS溶液、200μL溶解了2.5mM东莨菪内酯的PBS溶液。吹打混匀后置于30℃水浴锅中反应1h。取800μL反应液于5mL离心管中，添加800μL乙酸乙酯，充分混合均匀后14000rpm离心5min取上清液用于液相检测。结果显示，纯酶催化体系中，1mg酶蛋白可以催化500μM的东莨菪内酯(96.1mg/L)获得462.9μM滨蒿内酯(95.4mg/L)，摩尔转化率为92.58％。图9为用OMTsyn蛋白以东莨菪内酯为底物酶法合成滨蒿内酯的HPLC检测图。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。