技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用。
背景技术
红豆杉为红豆杉科红豆杉属乔本植物，原产于喜马拉雅和亚洲东南部部分地区。作为药用植物，红豆杉是远古第四纪冰川时期遗留下来的56种濒危物种植物中，最为珍稀的一种。目前，中国已将其列入国家一级珍稀濒危植物保护范围。红豆杉属植物在全世界有至少15种，我国有4种加一个变种。红豆杉可适应的生长环境较广，包括山地、温带、暖温带和热带的山麓，以及高山、山地、森林，如落叶林、常绿林或混合林等。于全球范围内，红豆杉的海拔分布大致在900～3700m这一区间。
中国红豆杉含有紫杉醇。据统计的临床实验结果表明，紫杉醇对多种癌症亦有显著疗效，总有效率达75％以上，主要用于治疗晚期乳腺癌、肺癌、卵巢癌及头颈部癌、软组织癌和消化道癌，被称为“抗癌明星”。截至目前，已有多个国家获准紫杉醇用于临床治疗。近来还研究发现紫杉醇对类风湿性关节炎、老年性痴呆症等都有很好的疗效。中国红豆杉树形美观大方，四季常青，果实成熟期红绿相映的颜色搭配令人陶醉，可广泛应用于水土保持、园艺观赏等方面，是新世纪改善生态环境，建设秀美山川的优良树种，现常用于高档的庭院绿化观赏。因此，在我国的广大山区都有引种和栽培。
东北红豆杉(Taxus cuspidata)是红豆杉科，红豆杉属乔木，高可达20米，胸径最大可达1米，树皮红褐色，有浅裂纹。东北红豆杉分布于中国吉林老爷岭、张广才岭及长白山区，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布，是一种濒危珍稀野生植物。东北红豆杉是红豆杉科红豆杉属的一种世界公认的珍稀濒危植物，具有极高的药用价值。目前，针对东北红豆杉形态、代谢和生长发育的研究已经取得了初步的进展，但其雌雄幼苗在形态学上高度相似，这给两者的区分鉴别工作带来了一定的困难。为推广高效主栽品种、大规模进行有效成分生产以及可持续地开展野生红豆杉资源保护，对东北红豆杉雌雄幼苗准确、快速的鉴别与区分，是亟待奠定的前提条件。
非靶向代谢组学(Untargeted metabolomics)是指采用LC-MS、GC-MS、NMR等技术，无偏向性地检测细胞、组织、器官或者生物体内受到干扰前后的全部内源性小分子代谢物的动态变化，并通过大数据筛选出差异代谢物，对差异代谢物进行相关通路分析，揭示产生这一系列变化的分子生物学机制。再收集代谢物的核质比信号，分析代谢谱，从而预测一条特定的代谢途径，以发现具有特征指示作用的代谢物。目前，通过代谢组技术来发现不同生物样本间的代谢标志物，已成为当前的一个研究热点。但在植物学及相关领域，利用该技术筛选代谢标志物并用于木本植物雌雄鉴定的研究鲜有报道。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的缺陷，提供东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，东北红豆杉素在东北红豆杉雄株幼苗中的含量远高于雌株幼苗，这一技术手段的提出，较好地解决了红豆杉人工育种和造林过程中遇到的树种鉴定等相关问题。
东北红豆杉素在作为鉴别东北红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，东北红豆杉素的化学特征主要为：其分子式为C44H48O15，分子量为816.85，化学结构式如下所示：
作为优选，东北红豆杉雄株幼苗中东北红豆杉素的质量含量是雌株幼苗中的4-6倍。
本发明的另一目的是提供东北红豆杉雌雄株的检测方法，具体为：
1)东北红豆杉雌雄株枝条样品研磨后，使用体积含量45％-55％的甲醇溶液提取样品的代谢物；具体是：
将120μL体积含量为50％的甲醇溶液预冷至-20℃，之后加入25mg研磨后东北红豆杉样品中，轻微震荡1min，室温下孵育10min，再置于-20℃下，过夜，4000×g离心20min后，将上清液于-80℃保存或干燥保存；
2)对上述提取液上清液进行LC-MS分析，通过东北红豆杉素的质量含量进行判断，若东北红豆杉素的质量含量高于0.2mg/g则为东北红豆杉雄株幼苗，低于0.006mg/g则为东北红豆杉雌株幼苗；
高效气相色谱条件如下：
色相系统为：SCIEX UPLC系统；
色谱柱温度为：35℃；
色谱柱为：安捷伦酸性丙烯酰胺柱(100mm×2.1mm，1.7μm,Waters，UK)；
流动相：流动相A为25mM醋酸铵+25mM氨水，流动相B为体积比为9:1的IPA和CAN混合液+体积含量为0.1％的蚁酸；
流动相梯度为：0-0.5min为体积含量95％的流动相B、0.5-9.5min为体积含量95％-65％的流动相B、9.5-10.5min为体积含量65％-40％的流动相B、10.5-12min为体积含量40％-95％的流动相B、12.2-15min为体积含量95％的流动相B；
质谱条件如下：
高分辨率质谱仪：TripleTOF5600plus型；
遮蔽气设置为30PSI，离子源Gas1为60PSI，离子源Gas2为60PSI；
加热温度为650℃；
对于正离子模式，离子喷射电压分别为5000V，对于负离子模式，离子喷雾电压浮动分别为-4500V；
质谱数据采集采用IDA模式，TOF质量范围为60-1200Da。
本发明的又一个目的是提供东北红豆杉素在鉴定东北红豆杉雌雄幼苗的试剂盒中的应用。
本发明能产生的有益效果：
1.本发明最终筛选得到一个区分不同性别东北红豆杉的代谢物标志物，并提供了相应的检测方法。本发明通过分析东北红豆杉雌雄株幼苗的代谢谱，鉴定代谢物的化学成分，成功筛选出存在显著差异的积累代谢物，从而得到了用于区分东北红豆杉雌雄株幼苗的代谢物标志物。
2.本发明鉴别方法精确度高，操作程序化，灵敏度高，结果准确可靠。
3.本发明可直接用于野外采集的样本，无需预先冷冻保存，采集得到的样本仅需在室温下简单干燥保存，即可用于代谢标志物的提取和检测。同时，本发明所需的检测样本生物量较少，仅为25mg，最大程度地减少了对需鉴定的珍稀红豆杉幼苗的伤害。
4.本发明通过高效色谱与质谱联用法的运用，获得了东北红豆杉雌雄株幼苗的非靶向代谢谱，鉴别了不同性别树种中的一系列代谢物，并定量分析得到二者间的差异代谢物。最终通过P值显著性分析法，筛选得到存在显著差异的代谢物。
附图说明
图1东北红豆杉雌雄株代谢物的注释及分类；
图2东北红豆杉雌雄代谢组主成分分析；
图3东北红豆杉素(Taxacin)标准品的液质图谱；
图4东北红豆杉雌雄标志性代谢物可靠性验证。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例来进一步为本发明进行详细说明。需当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
实施例1：东北红豆杉雌雄株幼苗代谢物的提取与对照控制样本制备
实验样本处理：
准确称取红豆杉的小枝(twig)各25mg用于代谢物的提取。
往研磨后的红豆杉样本中加入120μL预冷45％-55％甲醇提取液，在离心管中混匀。轻微震荡1min，室温下孵育10min，再于-20℃下静置，过夜，最后在4000×g离心20min后，上清液于-80℃保存或干燥保存；
对照样本处理：
为更好分析东北雌雄株两组样本之间的定量差异，准备一组对照控制样本。该对照样本按如下配置：分别取10个独立的东北红豆杉雄株实验样本和10个独立的东北红豆杉雌株实验样本，将这20个样本等体积混合。混合液等分为10份，制成对照控制样本。
实施例2：东北红豆杉雌雄株代谢物的注释
本发明的实施过程中，检测到大量质谱数据，包括峰值(peak)、保留时间(retention time)以及注释信息等。得到的质谱原始数据，通过XCMS，CAMERA和metaX等软件转化为XML格式。所获得的不同离子数据利用保留时间和核质比鉴定。将所得的离子信息比对其精确的分子量，并通过KEGG和HMDB在线数据库进行注释。
本发明最终共得到1134个有效离子特征，并以此产生745个成功注释的代谢物。注释结果显示，大部分鉴定出的代谢物都能被归入至少一条代谢途径。上述得到注释的代谢物主要归入氨基酸类代谢物(86个)、糖类代谢物(83个)、基础代谢物(43个)、萜类代谢物(34个)、甾体类代谢物(21个)、能量类代谢物(54个)、核苷酸类代谢物(222个)、脂肪酸类代谢物(144个)和其他代谢物(58个)，具体结果见图1。
实施例3：东北红豆杉雌雄幼株标志性差异代谢物筛选
为了筛选不同性别东北红豆杉的标志性差异代谢物，本发明检测了主成分分析(PCA)这种主要的质量控制参数。主成分分析结果则显示，PC1和PC2的变异值分别为51.57％和8.65％，这表明东北红豆杉不同性别的区分度较高，具体PCA分析结果见图2。统计结果显示，一共筛选得到78个显著差异积累的代谢物，其中38个于东北红豆杉雄株中显著积累，另40个在东北红豆杉雌株中显著积累。上述主要代谢物在不同性别的东北红豆杉间，存在有较大的差异。本发明通过分析显著差异积累代谢物，鉴定得到一种东北红豆杉素为不同性别东北红豆杉标志性差异代谢物。
实施例4：东北红豆杉素(Taxacin)标准品及其液质图谱
于化源网购买东北红豆杉素(Taxacin)标准品，其特征如下：CAS号为117229-54-6；分子量为816.85；分子式为C44H48O15。其标准质谱图如图3所示。利用上述标准品，精确测定红豆杉样本中的东北红豆杉素含量。
实施例:5：区分不同性别东北红豆杉标志性差异代谢物可靠性验证实例
五年生东北红豆杉雌雄株栽培苗均种植于杭州师范大学实验田地。将采集得到的样本分别编号为：Male1-6(东北红豆杉雄株)和Female1-6(东北红豆杉雌株)。
采集得到的红豆杉小枝放入40℃烘箱内，充分干燥后，使用孔径为0.42mm的筛子进行过滤，每个样本精确称量出0.5g干粉，向其加入15mL100％的甲醇，并混合均匀。混合液在150W，40kHz超声波下处理30min。得到的裂解液进行4000×g离心20min后，上清液转入新的离心管中。于真空条件下干燥后，再次将其溶解于50％的甲醇中以备用。用10倍体积的稀释所得样品，而后对其进行UPLC-MS/MS定量检测。检测结果表明，东北红豆杉素在雄性东北红豆杉幼苗中的平均含量显著高于雌性幼苗。具体结果如图4所示。经上述结果验证表明，东北红豆杉素作为一种区分不同性别东北红豆杉的标志性代谢物，具有高度的可靠性。本发明基于代谢组学技术，筛选得到了一种可用于区分不同性别东北红豆杉幼苗的标志性代谢物，且所需样本仅为25mg，准确率高达100％。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。