本发明涉及在甘油三酯油(诸如例如植物油)上生长的宿主细胞特别是产油酵母(诸如例如耶氏酵母)中产生视黄醇乙酸酯的新方法，其中该宿主细胞表现出改善的脂肪酶活性，使得视黄醇向脂肪酸视黄酯(FARE)的转化降低或消除。这种方法在用于生产维生素A的生物技术方法中特别有用。
类视黄醇(包括维生素A及其前体)的目前的化学生产方法具有一些不期望的特征，诸如例如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已研究了包括微生物转化步骤的制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的其他方法，这将导致更经济以及生态的维生素A生产。
通常，生产类视黄醇的生物系统在工业上是难以处理的和/或以如此低水平产生化合物，以至于商业规模分离是不实际的。除了中间体的不稳定性之外，主要的限制因素之一是通过视黄醇的酶促转化，特别是使用在甘油三酯(诸如例如植物油)上生长的产油宿主细胞产生的副产物(诸如例如脂肪酸视黄酯(FARE))的相对高的产量。
尽管不稳定性可通过在宿主细胞中表达高特异性乙酰化酶(ATF)导致增加的视黄醇乙酸酯的积累来解决(参见例如WO2020/141168)，但相对高百分比的视黄醇对于维生素A生产仍然是“损失”的，即转化成包括FARE的不期望的副产物，其难以纯化且不形成晶体，而是形成蜡。因此，高浓度的FARE限制了纯产物的大规模工业生产。
因此，在使用宿主细胞特别是在甘油三酯上生长的产油宿主细胞诸如耶氏酵母进行的维生素A生物生产中，增加视黄醇乙酸酯的百分比和减少FARE形成是一个持续的任务。
令人惊讶地，我们现在发现，与使用相应的未修饰的宿主细胞的方法相比，在甘油三酯(诸如例如植物油)上生长的宿主细胞特别是产油酵母(诸如例如如本文定义的产生视黄醇乙酸酯的耶氏酵母)中的内源脂肪酶活性的修饰可导致FARE形成降低或消除，并且任选地进一步增加视黄醇乙酸酯的百分比，所述内源脂肪酶活性的修饰包括参与植物油预消化成甘油和脂肪酸的某些内源酶的修饰(特别是阻断)，同时添加某些外源或异源脂肪酶活性，例如真菌脂肪酶活性，特别是来自产油酵母(诸如假丝酵母物种，特别是皱褶假丝酵母(Candida rugosa))的脂肪酶活性。
特别地，本发明涉及能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞，诸如真菌宿主细胞，优选地产油酵母细胞，诸如例如耶氏酵母，所述产生类视黄醇的宿主细胞包含：
(1)一种或多种遗传修饰，即编码参与将植物油预消化成甘油和脂肪酸的酶的某些内源基因、特别包括例如编码内源脂肪酶和/或酯酶的基因的降低或消除，优选地消除，包括但不限于编码具有与耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4等同的活性的酶的内源基因的活性的修饰，诸如与SEQ ID NO:1、3、5、7或它们的组合具有至少约50％诸如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的多肽，其中SEQ ID NO:1对应于可从解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)获得的LIP2，SEQ ID NO:3对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP3，SEQ ID NO:5对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP8，SEQ ID NO:7对应于可从解脂耶氏酵母获得的LIP4；以及
(2)添加具有脂肪酶活性，特别是真菌脂肪酶活性，特别是来自假丝酵母物种的异源酶，诸如例如皱褶假丝酵母脂肪酶(CrLIP)活性，包括但不限于具有与CrLIP1等同的活性的酶，诸如与SEQ ID NO:9具有至少约75％同一性诸如例如约80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％同一性的多肽。
如本文所用，“宿主细胞”是指产生类视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，特别是产油酵母，其包含如本文所述的两种或更多种(遗传)修饰，诸如脂肪酶活性的修饰，其中一种修饰包括遗传修饰，诸如例如降低/消除编码具有脂肪酶活性的酶的内源基因的活性，诸如包括等同于/对应于解脂耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP4和/或LIP8活性的活性，包括但不限于相应基因的缺失，并且其中一种修饰包括添加异源脂肪酶活性，诸如例如通过宿主细胞的进一步遗传修饰，即引入编码异源脂肪酶的异源基因/多核苷酸，诸如等同于/对应于真菌脂肪酶的活性，特别是来自假丝酵母物种的脂肪酶活性，诸如例如皱褶假丝酵母CrLIP1活性，特别是源自假丝酵母物种的脂肪酶，优选地皱褶假丝酵母，更优选地CrLIP1，或经由添加异源脂肪酶，即在宿主细胞的发酵期间施用有效量的异源酶。包含上述修饰的宿主细胞也称为“经修饰的宿主细胞”。术语“能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞”和“产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞”在本文中可互换使用。
如本文所用，“野生型宿主细胞”是指相对于上述脂肪酶活性修饰而言为野生型即未修饰的相应宿主细胞。因此，在野生型宿主细胞中，如本文定义的对应内源酶在体内(仍)表达并有活性，并且没有添加如本文定义的外源脂肪酶活性。
如本文所用，如果编码蛋白质的mRNA可通过Northern印迹检测和/或蛋白质可通过质谱检测，则酶是“体内表达并有活性”。关于如本文定义的外源脂肪酶活性，其意指改善包含如本文定义的内源脂肪酶活性的修饰的宿主细胞的甘油三酯利用的能力。
合适的宿主细胞选自产生类视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，其中视黄醇乙酸酯是经由通过乙酰化酶(ATF)催化的视黄醇的酶促转化形成，例如真菌宿主细胞，包括产油酵母细胞，诸如例如红冬孢酵母(Rhodosporidium)、油脂酵母(Lipomyces)或耶氏酵母，优选地耶氏酵母，更优选地解脂耶氏酵母，其包含如本文定义的脂肪酶活性的修饰。
在一方面，本发明涉及如本文定义的能够形成视黄醇乙酸酯的经修饰的宿主细胞，以及在甘油三酯(诸如例如植物油)上生长的此类经修饰的宿主细胞在视黄醇乙酸酯生产方法中的用途，其中与使用相应的未修饰/野生型宿主细胞形成FARE相比，在发酵期间FARE的形成减少，例如与在甘油三酯上生长的如本文定义的未修饰的宿主细胞的发酵相比，特别减少至少约50％至80％。根据本文所述的一些优选实施方式，FARE的形成甚至可被消除，即与使用在甘油三酯上生长的相应未修饰宿主细胞相比减少100％，其中FARE的百分比基于总类视黄醇。
如本文所用，术语“编码参与将植物油预消化成甘油和脂肪酸的酶的内源基因”是指具有脂肪酶活性和/或酯酶活性的内源酶。术语“脂肪酶”在本文中与术语“酯酶”或“具有脂肪酶和/或酯酶活性的酶”可互换使用。它是指通常在产油宿主细胞中表达的参与将甘油三酯油(诸如例如植物油)预消化成甘油和脂肪酸的酶。在如本文定义的宿主细胞中待修饰的合适的酶可选自属于EC类3.1.1.-的内源酶，包括但不限于一种或多种具有对应于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4活性的活性的酶，包括一种或多种与SEQ ID NO:1、3、5、7或它们的组合具有至少约50％诸如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的酶。
如本文所用，具有“对应于/等同于耶氏酵母中相应LIP活性的活性”的酶不仅包括源自耶氏酵母(例如解脂耶氏酵母，诸如例如耶氏酵母LIP2、LIP3、LIP8、LIP4或它们的组合)的基因，而且包括具有等同酶促活性但源自另一来源生物体(特别是产生视黄醇乙酸酯的产油宿主细胞)的酶，其中此类等同的内源脂肪酶基因的修饰将导致如本文定义的FARE形成的减少和/或视黄醇向视黄醇乙酸酯转化的增加。
在一个实施方式中，如本文定义的经修饰的宿主细胞，诸如经修饰的产生视黄醇乙酸酯的产油宿主细胞，包含与SEQ ID NO:5具有至少约50％诸如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的多肽的修饰，包括但不限于可从解脂耶氏酵母获得的LIP8，其中所述多肽的活性被降低或消除，优选地被消除，包括基因表达的降低或消除，其中在甘油三酯(诸如例如植物玉米油)作为碳源的存在下的发酵中使用此类经修饰的宿主细胞导致由如本文定义的由视黄醇的转化引起的FARE形成减少，任选地由视黄醇的转化引起的视黄醇乙酸酯的百分比进一步增加，诸如例如与使用相应的未修饰的宿主细胞相比基于总类视黄醇约10％-30％的范围的增加。特别地，(经修饰的)宿主细胞选自耶氏酵母，诸如解脂耶氏酵母，其中根据SEQ ID NO:5的LIP8(包括由根据SEQ ID NO:6的多核苷酸编码的多肽)的活性被降低或消除，优选地被消除，导致与使用在甘油三酯(诸如例如植物油)上生长的相应未修饰宿主细胞的FARE形成相比，基于总类视黄醇的FARE形成减少至少约50％-80％。LIP8或来自如本文定义的另一种产油酵母的对应酶的降低或消除可与另外的内源酶的降低或消除(特别是消除)组合，该另外的内源酶包括但不限于具有与耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP4活性等同的活性的酶，包括与选自由SEQ ID NO:1、3、7以及它们的组合组成的组的序列具有至少约50％同一性的酶。特别优选的是(经修饰的)宿主细胞，其中对应于耶氏酵母LIP2、LIP3、LIP8和任选地与LIP4一起的内源酶活性被降低或消除，特别是被消除，诸如例如对应的基因是无活性的，包括但不限于相应基因的缺失。
如本文所用，术语“添加外源或异源脂肪酶活性”是指添加不是由宿主细胞的内源基因编码的具有脂肪酶活性的酶。合适的酶可选自属于EC类3.1.1-的酶，包括但不限于可商购获得的酶，例如可从Novozymes、DSM、Amano、Sigma、Creative Enzymes或其他供应商获得的酶，诸如例如源自假丝酵母或根霉物种，特别是源自皱褶假丝酵母(C.rugosa)、柱状假丝酵母(C.cylindracea)、雪白根霉(R.niveus)或米根霉(R.oryzae)的异源真菌酶。术语“添加”意指体外添加，即在宿主细胞发酵期间以有效量施用此类异源酶，诸如例如施用包含一种或多种酶的混合物的水溶液，或体内表达，即将编码所述异源酶的基因/多核苷酸添加/引入宿主细胞中-即用编码如本文定义的所述异源酶的多核苷酸转化宿主细胞-使得具有脂肪酶活性的相应异源酶在体内表达并有活性。优选地，用表达皱褶假丝酵母脂肪酶(诸如例如具有对应于CrLIP1的活性的酶，包括与SEQ ID NO:9具有至少约75％同一性诸如例如约80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％同一性的酶)的异源多核苷酸转化宿主细胞。
如本文所用，具有“对应于/等同于假丝酵母中的相应LIP活性的活性”的酶不仅包括源自假丝酵母(例如皱褶假丝酵母)的基因，诸如例如CrLIP1，而且包括具有等同的酶促活性但源自另一来源生物体(特别是真菌来源)的酶，其中添加此类外源或异源酶活性将导致如本文定义的FARE形成的减少和/或视黄醇向视黄醇乙酸酯转化的增加。
在一个优选的实施方式中，异源酶在体内表达，即将编码与SEQ ID NO:9具有至少约75％同一性的异源脂肪酶的对应多核苷酸引入如本文定义的宿主细胞并在所述宿主细胞中表达，导致与使用如本文定义的未修饰宿主细胞的视黄醇乙酸酯生产方法相比，FARE的减少的范围为至少约50至80％，诸如例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至高达100％。
根据另一个优选的实施方式，如本文定义的宿主细胞包含并表达(经遗传)修饰的异源脂肪酶，例如具有等同于CrLIP1的活性的脂肪酶，诸如包含一个或多个与SEQ ID NO:9具有至少约75％同一性的序列中的修饰诸如氨基酸取代(一个或多个)的假丝酵母脂肪酶，所述一个或多个氨基酸取代位于对应于选自由根据SEQ IDNO:9的多肽位置296、344、345、448以及它们的组合组成的组的氨基酸残基(一个或多个)的位置(一个或多个)，优选地包含一个或多个在对应于SEQ ID NO:9中的氨基酸残基296、344、448或它们的组合的位置上的氨基酸取代。
在一个具体的实施方式中，添加到如本文定义的(经修饰的)宿主细胞中并在其中体内表达的(经遗传修饰的)异源脂肪酶包含一个或多个氨基酸取代，其中在对应于根据SEQ ID NO:9的多肽中残基296的位置处的氨基酸取代产生丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，优选地丙氨酸或缬氨酸，诸如例如选自由F296A、F296V、F296I、F296S、F296N和F296Q组成的组的氨基酸取代，其中在对应于SEQ ID NO:9中氨基酸位置F296的残基上苯丙氨酸的取代可导致FARE减少的范围为约80％至100％，即在使用如本文定义的在甘油三酯上生长的经修饰的宿主细胞的视黄醇乙酸酯生产方法中，与使用未修饰的宿主细胞的相应方法相比FARE形成的消除。
在一个具体的实施方式中，添加到如本文定义的(经修饰的)宿主细胞中并在其中体内表达的(经遗传修饰的)异源脂肪酶包含一个或多个氨基酸取代，其中在对应于根据SEQ ID NO:9的多肽中残基344的位置处的氨基酸取代产生异亮氨酸或色氨酸，诸如例如选自由F344I或F344W组成的组的氨基酸取代。
在一个具体的实施方式中，添加到如本文定义的(经修饰的)宿主细胞中并在其中体内表达的(经遗传修饰的)异源脂肪酶包含一个或多个氨基酸取代，其中在对应于根据SEQ ID NO:9的多肽中残基345的位置处的氨基酸取代产生亮氨酸，诸如例如选自由F345L组成的组的氨基酸取代，其中在对应于SEQ ID NO:9中氨基酸位置F345的残基上苯丙氨酸的取代可导致FARE减少的范围为约80％至100％，即在使用如本文定义的在甘油三酯上生长的经修饰的宿主细胞的视黄醇乙酸酯生产方法中，与使用未修饰的宿主细胞的相应方法相比FARE形成的消除。
在一个具体的实施方式中，添加到如本文定义的(经修饰的)宿主细胞中并在其中体内表达的(经遗传修饰的)异源脂肪酶包含一个或多个氨基酸取代，其中在对应于根据SEQ ID NO:9的多肽中残基448的位置处的氨基酸取代产生组氨酸、丙氨酸或色氨酸，诸如例如选自由F448H、F448A或F448W组成的组的氨基酸取代，其中在对应于SEQ ID NO:9中氨基酸位置F448的残基上苯丙氨酸的取代可导致在使用如本文定义的在甘油三酯上生长的经修饰的宿主细胞的视黄醇乙酸酯生产方法中与使用未修饰的宿主细胞的相应方法相比FARE减少的范围为约80％至100％。
优选地，宿主细胞表达包含一个或多个在对应于氨基酸残基296、344、345和/或448的位置上的氨基酸取代的经修饰的异源脂肪酶，其中在对应于残基296的位置上的取代例如F296A、F296V、F296I、F296S、F296N或F296Q任选地与在对应于残基344的位置处的一个或多个取代(特别是F344I或F344W)和/或在对应于残基345的位置处的取代(特别是F345L)和/或在对应于残基448的位置处的取代(特别是F448H、F448A或F448W)组合，最优选地选自例如F296A_F344W或F296V_F448A的两个氨基酸取代与内源脂肪酶活性的修饰组合，诸如等同于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4的酶活性的修饰，即所述内源酶活性被降低或消除，特别是其中对应内源基因的活性被降低或消除，包括但不限于对应基因的缺失，更优选地其中编码内源LIP8的基因失活，诸如例如缺失，或其中编码内源LIP2、LIP3和LIP8的基因失活，诸如例如缺失，或其中编码内源LIP2、LIP3、LIP8和LIP4的基因失活，诸如例如缺失，其中失活意指在宿主细胞中不能(再)检测到对应内源脂肪酶活性。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及如本文定义的能够形成视黄醇乙酸酯的经修饰的宿主细胞以及此类经修饰的宿主细胞在视黄醇乙酸酯生产方法中的用途，其中视黄醇向视黄醇乙酸酯的转化增加，特别是其中与使用在甘油三酯(诸如例如植物油)上生长的相应未修饰/野生型宿主细胞的视黄醇乙酸酯的百分比相比，基于总类视黄醇的视黄醇乙酸酯百分比增加至少约10％至30％。
如本文所用，酶的“活性”，特别是如本文定义的脂肪酶或酯酶的活性，被定义为“比活性”，即其催化活性，即其催化由给定底物形成产物(诸如例如视黄基脂肪酯的形成)的能力。如果酶(例如脂肪酶或酯酶)在体内，即在如本文定义的宿主细胞内或在存在合适底物的系统内发挥其催化活性，则该酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文定义的脂肪酶的活性，包括但不限于具有对应于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4活性的活性的酶。评价如本文定义的脂肪酶/酯酶参与视黄基脂肪酯形成的能力的分析方法是本领域已知的，并且包括经由HPLC等测量。关于如本文定义的LIP2、LIP3、LIP8、LIP4和/或异源脂肪酶(例如真菌脂肪酶，诸如例如假丝酵母脂肪酶，特别是CrLIP1)的活性，技术人员可测量与由视黄醇转化形成的视黄醇乙酸酯相比的由视黄醇转化形成的视黄基脂肪酯，两者均用经修饰的和相应的野生型宿主细胞测量。
如本文所用，具有“降低或消除”活性的酶，特别是如本文定义的脂肪酶或酯酶意指其比活性的降低，即降低/消除的催化由给定底物形成产物诸如在发酵期间由甘油三酯(诸如例如植物油，优选地玉米油)转化为甘油和脂肪酸的能力，包括编码此类脂肪酶或酯酶的相应(内源)基因的活性降低或消除。100％的降低在本文中称为酶活性的消除，其可例如经由在编码所述酶的内源基因中的缺失、插入、移码突变、错义突变或提前终止密码子或用已知方法阻断所述内源基因(一个或多个)的表达和/或活性，特别是与添加如本文定义的外源或异源脂肪酶活性组合来实现。
根据本发明的(经修饰的)宿主细胞可源自解脂耶氏酵母，如WO2019/058001或WO2019/057999中公开的，因此被进一步遗传修饰，其中经由异源表达β-胡萝卜素氧化酶(BCO)、视黄醇脱氢酶(RDH)和/或乙酰转移酶(ATF)优化由β-胡萝卜素形成视黄醇乙酸酯。特别地，如本文定义的经修饰的宿主细胞可表达源自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)或斑马鱼(Danio rerio)的BCO、源自藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)的RDH和真菌ATF，诸如例如源自拉茜斯酵母(Lachancea)或酵母属(Saccharomyces)的ATF。为了在如本文定义的方法中增强β-胡萝卜素向视黄醛向视黄醇向视黄醇乙酸酯的转化，所述酶可包含一个或多个导致视黄醇向视黄醇乙酸酯的乙酰化改善的突变。
在如本文定义的能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞中引入修饰(一个或多个)以便产生基因和/或蛋白质的较少或没有拷贝，该基因和/或蛋白质诸如内源脂肪酶或酯酶和如本文定义的相应基因，包括生成如本文定义的能够形成视黄醇乙酸酯的经修饰的合适宿主细胞，该宿主细胞在对应于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4的内源酶中具有降低/消除的活性，可包括使用弱启动子，或引入相应酶(如本文所述)(的部分)的一个或多个突变(例如插入、缺失/敲除或点/移码/错义突变、提前终止密码子)，特别是其调节元件，导致所述酶活性的降低/消除，诸如例如经由体内诱变失活，例如通过催化残基的突变或通过产生干扰在由宿主细胞分泌时活化脂肪酶/酯酶所需的蛋白质折叠或前序列或原序列切割的突变或缺失。技术人员知道如何遗传操作或修饰如本文定义的宿主细胞，导致如本文定义的此类内源活性例如脂肪酶或酯酶活性的降低/消除。这些遗传操作包括但不限于例如基因置换、基因扩增、基因破坏、使用质粒、病毒或其他载体的转染、转化。此类遗传操作的示例可例如影响由如本文定义的酶的N-末端区域介导的与DNA的相互作用或与其他效应分子的相互作用。特别地，导致特异性酶活性降低/消除的修饰可在蛋白质的功能(诸如对于催化活性的功能)部分中进行。此外，酶比活性的降低/消除可通过使所述酶与特异性抑制剂或与它们特异性相互作用的其他物质接触来实现。为了鉴定此类抑制剂，可表达相应的酶，诸如例如如本文定义的某些内源脂肪酶，并且在疑似抑制其活性的化合物存在下测试其活性。
如本文所用，导致基因活性消除的基因的“缺失”包括核酸序列中可导致功能减弱的等位基因的所有突变，包括但不限于缺失、插入、移码突变、错义突变和提前终止密码子，其中缺失意指在宿主细胞中不能(再)检测到对应的基因/蛋白质活性，诸如特别是内源脂肪酶活性。
可以不同的方式进行核酸或氨基酸中突变的产生，即诱变，诸如例如通过随机或侧定向诱变，由试剂诸如例如辐射、化学处理、或遗传元件的插入引起的物理损伤。技术人员知道如何引入突变。
因此，本发明还包括鉴定待修饰的内源酶的方法，诸如例如经由降低或消除特定的酶活性，包括具有对应于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP8和/或LIP4的活性的脂肪酶/酯酶，该方法包括在合适的宿主细胞，诸如例如产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞中逐个过表达相应的内源基因的步骤，以观察其是否放大负面效应，如降低视黄醇乙酸酯的百分比。随后，诸如例如经由缺失使对应基因失活，可降低/消除这些酶的活性，其中，该过表达导致在所述宿主细胞发酵期间减少视黄醇乙酸酯和/或增加FARE，并挑取具有减少的FARE形成的克隆。
一个具体的实施方式涉及在如本文定义的经修饰的宿主细胞中生产视黄醇乙酸酯的方法，该方法包括鉴定如本文定义的待修饰的合适的内源脂肪酶，该方法包括以下步骤：
将植物油预消化成甘油和脂肪酸，
(2)基于与SEQ ID NO:1、3、5、7至少约50％诸如例如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％的序列同源性选择内源脂肪酶或酯酶，
(3)所选择的基因的过表达以及FARE形成和/或基于总类视黄醇的视黄醇乙酸酯百分比的比较，
(4)基因的选择，其中过表达对FARE形成具有积极影响和/或对类视黄醇混合物中视黄醇乙酸酯百分比具有消极影响，以及
(5)所选择的基因的诸如例如经由缺失的降低或消除，例如失活，这些所选择的基因在过表达时对FARE形成具有积极影响和/或对视黄醇乙酸酯形成具有消极影响。
优选地，此类方法还包括添加如本文定义的合适的异源脂肪酶的步骤，特别是其中该异源脂肪酶包含如本文定义的一个或多个氨基酸取代。
根据本发明的一个具体方面，如本文定义的经修饰的宿主细胞可用于减少维生素A发酵过程中FARE的形成并任选地增加基于总类视黄醇并且优选地基于由经修饰的宿主细胞在存在甘油三酯作为碳源的发酵中产生的类视黄醇的视黄醇乙酸酯百分比。具有如本文定义的内源脂肪酶活性的降低或消除的如本文定义的经修饰的宿主细胞可包含进一步的修饰，包括引入(和表达)(宿主优化的)异源多核苷酸，诸如例如如本文定义的异源脂肪酶。技术人员知道如何生成此类经修饰的多核苷酸。应理解，本发明包括此类宿主优化的核酸分子以及包含所谓沉默突变的分子，只要它们仍然产生携带如本文定义的经修饰的脂肪酶/酯酶活性的经修饰的宿主细胞。
术语“序列同一性”、“％同一性”或“序列同源性”在本文中可互换使用。为了本发明的目的，在此定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性的百分比，将序列比对以用于最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可在被比较的两个序列中的任何一个序列中引入空位。此类比对可在被比较的序列的全长上进行。可替换地，可在较短的长度上，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是在所报告的比对区域上两个序列之间的相同匹配的百分比。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列均可通过算法进行比对。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(2.8.0版本或更高版本，EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European MolecularBiology Open Software Suite)(2000)，Rice、Longden和Bleasby，Trends in Genetics16,(6)pp276—277，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，EBLOSUM62用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的任选参数是空位-开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但当使用不同的算法时，两个序列的总体百分比同一性没有显著改变。
如上所述通过程序NEEDLE比对后，如下计算查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比：比对中显示两个序列中相同氨基酸或相同核苷酸的对应位置的数目除以在减去比对中空位总数后比对的总长度。如本文定义的同一性可通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中被标记为“最长同一性”。如果被比较的两个氨基酸序列在它们的任何氨基酸上没有不同，则它们是相同的或具有100％同一性。关于源自植物的酶，技术人员已知源自植物的酶可含有叶绿体靶向信号，其将经由特定的酶诸如例如叶绿体加工酶(CPE)被切割。
在一个实施方式中，用于本发明的宿主细胞可表达另外的酶，诸如异源ATF，特别是真菌ATF，其包含选自[NDEHCS]-H-x(3)-D-[GA]的至少7个氨基酸残基的高度保守的部分氨基酸序列(基序是Prosite语法，如https://prosite.expasy.org/scanprosite/scanprosite_doc.html中定义的)，其中“x”表示任意氨基酸，并且中心组氨酸是酶结合口袋的一部分，优选地其中该7个氨基酸基序选自[NDE]-H-x(3)-D-[GA]，更优选地选自[ND]-H-x(3)-D-[GA]，最优选地选自对应于根据WO2020/141168中的SEQ ID NO:1的多肽中的位置N218至G224的N-H-x(3)-D-[GA]。此类酶的示例可特别地选自米拉氏拉茜斯酵母(L.mirantina)、发酵拉茜斯酵母(L.fermentati)、贝酵母(S.bayanus)或异常威克汉姆酵母(W.anomalus)，诸如例如根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的LmATF1，如WO2019/058001中公开的SbATF1、LffATF1、LfATF1、Wa1ATF1或Wa3ATF1，更优选所述ATF在与WO2020/141168中的SEQ ID NO:1具有至少约20％诸如例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或至多100％同一性的序列中包含一个或多个氨基酸取代，其中该一个或多个氨基酸取代位于对应于选自由以下项组成的组的氨基酸残基的位置处：位置68、69、72、73、171、174、176、178、291、292、294、301、307、308、296、312、320、322、334、362、405、407、409、480、483、484、490、492、520、521、522、524、525、526以及它们的组合，并且如在WO2020/141168的表4中具体例示的，最优选地在对应于WO2020/141168中SEQ ID NO:1中的氨基酸残基69、407、409、480、484以及它们的组合的位置上包含一个或多个氨基酸取代。
在一个具体的实施方式中，用于根据本发明的方法的经修饰的宿主细胞在对应于根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的ATF中的残基69的位置处包含氨基酸取代，从而在所述残基处产生天冬酰胺、丝氨酸或丙氨酸，诸如例如经由天冬酰胺(H69N)、丝氨酸(H69S)或丙氨酸(H69A)(优选H69A)取代组氨酸。所述经修饰的酶可源自酵母，诸如例如米拉氏拉茜斯酵母、发酵拉茜斯酵母、异常威克汉姆酵母或贝酵母，优选地源自米拉氏拉茜斯酵母，任选地与对应于根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的ATF中的残基407的位置处的氨基酸取代组合，从而在所述残基处产生异亮氨酸，诸如例如经由异亮氨酸取代缬氨酸(V407I)，任选地与对应于根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的ATF中的残基409的位置处的氨基酸取代组合，从而在所述残基处产生丙氨酸，诸如例如经由丙氨酸取代甘氨酸(G409A)，任选地与对应于根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的ATF中的残基480的位置处的氨基酸取代组合，从而在所述残基处产生谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或谷氨酰胺，诸如例如经由谷氨酸(S480E)、赖氨酸(S480L)、甲硫氨酸(S480M)、苯丙氨酸(S480F)或谷氨酰胺(S480Q)取代丝氨酸，任选地与对应于根据WO2020/141168中SEQ ID NO:1的ATF中的残基484的位置处的氨基酸取代组合，从而在所述残基处产生亮氨酸，诸如例如经由亮氨酸(I484L)取代异亮氨酸。所述经修饰的酶可源自酵母，诸如例如米拉氏拉茜斯酵母、发酵拉茜斯酵母、异常威克汉姆酵母或贝酵母，优选地源自米拉氏拉茜斯酵母。在最优选的实施方式中，用于根据本发明的方法的ATF是包含氨基酸取代S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L的经修饰的ATF，并且可从米拉氏拉茜斯酵母获得。
任选地，如本文定义的能够从视黄醇转化产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，诸如例如耶氏酵母，表达用于生物合成β-胡萝卜素和/或另外用于催化β-胡萝卜素转化成视黄醛和/或视黄醛转化成视黄醇的另外的酶。技术人员知道使用/表达哪些基因用于β-胡萝卜素的生物合成和/或β-胡萝卜素向视黄醇的生物转化。在需氧或厌氧条件下，在补充有适当营养物的水性培养基(包括存在作为碳源的甘油三酯油，诸如例如植物油，特别是玉米油)中培养如本文定义的进一步能够表达如本文定义的ATF基因和/或维生素A生物合成所需的另外的基因的如本文定义的此类经修饰的宿主细胞，其中所述水性培养基对于技术人员针对不同宿主细胞是已知的。宿主细胞的培养/生长可以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。根据宿主细胞，优选地，类视黄醇诸如例如维生素A和前体诸如视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯的产生可变化，如技术人员已知的。选自耶氏酵母的产生β-胡萝卜素和类视黄醇的宿主细胞的培养和分离描述于例如WO2008/042338中。
用于本发明的碳源是所有合适的甘油三酸酯油，包括但不限于含有游离脂肪酸如油酸、棕榈酸、硬脂酸或亚油酸和甘油的预水解油，诸如例如植物油，包括但不限于玉米油、橄榄油、棉籽油、油菜籽油、芝麻油、卡诺拉油、红花油、向日葵油、大豆油、葡萄籽油或花生油，优选地玉米油。
可在合适的时刻，例如当一种或多种营养物耗尽时，从培养物中收获包括视黄醇乙酸酯的发酵产物。根据宿主细胞，优选地，类视黄醇诸如例如维生素A、其前体和/或衍生物诸如视黄醛、视黄醇、视黄醇乙酸酯，特别是视黄醇乙酸酯的产生可变化，如技术人员已知的。类视黄醇(包括但不限于视黄醇、视黄醇乙酸酯、维生素A)可用作食品、饲料、制药或化妆品工业中的成分/制剂。
在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种生产视黄醇乙酸酯的方法，其中基于总类视黄醇的FARE的百分比降低至少约50％至80％，所述方法包括以下步骤：
(a)提供能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞，
(b)将一个或多个修饰引入所述宿主细胞的基因组中，诸如将修饰(一个或多个)引入属于EC类3.1.1-的具有脂肪酶/酯酶活性的酶(一个或多个)中，诸如例如降低/消除酶活性，包括但不限于缺失相应基因，特别是消除对应于耶氏酵母LIP8的脂肪酶活性和任选地进一步消除对应于耶氏酵母LIP2和/或LIP3和/或LIP4的酶活性，其中该经修饰的宿主细胞在作为碳源的甘油三酯油(诸如例如植物玉米油)上生长；
(c)添加如本文定义的异源脂肪酶活性
(d)任选地引入另外的修饰(一种多多种)，其包括如本领域技术人员已知的参与视黄醇、视黄醇乙酸酯和/或维生素A产生的(异源)酶的一个或多个拷贝的表达，
(d)在导致形成视黄醇乙酸酯的合适条件下培养此类经修饰的宿主细胞，其中该经修饰的宿主细胞在作为碳源的甘油三酯(特别是植物油)上生长；以及
(e)任选地从培养(发酵)培养基中分离和/或进一步纯化视黄醇乙酸酯。
如本文所用，“类视黄醇”或“类视黄醇混合物”包括维生素A、维生素A的前体和/或中间体，诸如β-胡萝卜素切割产物，也称为脱辅基类胡萝卜素，包括但不限于视黄醛、视黄酸、视黄醇、甲氧基视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄基脂肪酯、4-酮-类视黄醇、3-羟基-类视黄醇或它们的组合。类视黄醇的生物合成描述于例如WO2008/042338中。能够在例如发酵过程中产生类视黄醇的宿主细胞称为“产生类视黄醇的宿主细胞”。维生素A途径的基因和生成产生类视黄醇的宿主细胞的方法是本领域已知的(参见例如WO2019/058000)，包括但不限于β-胡萝卜素氧化酶、视黄醇脱氢酶和/或乙酰转移酶。能够将视黄醇乙酰化成视黄醇乙酸酯的合适的乙酰转移酶(ATF)公开于例如WO2019/058001或WO2020/141168中。导致高百分比的反式视黄醛的合适的β-胡萝卜素氧化酶描述于例如WO2019/057999中。如本文所用，“产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞”表达催化视黄醇转化成视黄醇乙酸酯的合适的ATF。
术语“甘油三酯”和“甘油三酯油”在本文中可互换使用。
本文可互换使用的“FARE”或“视黄基脂肪酯”包括长链视黄酯。这些长链视黄酯定义由至少约8(诸如例如9、10、12、13、15或20)个碳原子和至多约26(诸如例如25、22、21或更少)个碳原子与优选地至多约6个不饱和键(诸如例如0、1、2、4、5、6个不饱和键)组成的烃酯。长链视黄酯包括但不限于亚油酸、油酸或棕榈酸。
如本文所用，“维生素A”可以是在水溶液、固体和制剂中发现的维生素A的任何化学形式，并且包括视黄醇、视黄醇乙酸酯和视黄酯。它还包括游离酸形式或解离为阴离子的视黄酸，诸如例如未解离的视黄酸。
如本文所用，“视黄醛”以IUPAC名称(2E,4E,6E,8E)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)壬-2,4,6,8-四烯醛而著称。它包括顺式和反式异构体，诸如例如11-顺式视黄醛、13-顺式视黄醛、反式视黄醛和全反式视黄醛。出于本发明的目的，反式视黄醛的形成是优选的，其可经由使用立体选择性β-胡萝卜素氧化酶产生，诸如在例如WO2019/057999中所述。
如本文所用，“类胡萝卜素”包括长的40个碳共轭的类异戊二烯多烯，其在自然界中通过连接两个20个碳的香叶基香叶基焦磷酸分子而形成。这些包括但不限于八氢番茄红素、番茄红素和胡萝卜素，诸如例如β-胡萝卜素，其可在4-酮位置或3-羟基位置上被氧化以产生角黄素、玉米黄质或虾青素。类胡萝卜素的生物合成描述于例如WO2006/102342中。能够经由一个或多个产生类胡萝卜素(特别是β-胡萝卜素)的酶促转化步骤产生类胡萝卜素的细胞，即其中参与类胡萝卜素产生的相应多肽在体内表达并有活性的细胞在本文中称为产生类胡萝卜素的宿主细胞。生成产生类胡萝卜素的细胞的基因和方法是本领域已知的，参见例如WO2006/102342。根据待生产的类胡萝卜素，可能涉及不同的基因。
根据本发明的转化被定义为特异性酶促活性，即本文所述的酶的催化活性，包括但不限于脂肪酶或酯酶的酶促活性，特别是属于EC类3.1.1-的参与视黄醇转化成视黄基脂肪酯的酶、β-胡萝卜素氧化酶(BCO)、视黄醇脱氢酶(RDH)、乙酰转移酶(ATF)。
关于本发明，应理解，生物体，诸如例如微生物、真菌、藻类或植物也包括具有相同生理特性的此类物种的同义词或基名词，如由国际原核生物命名法规或国际藻类、真菌和植物命名法规(墨尔本法规)所定义的。因此，例如，菌株米拉氏拉茜斯酵母是源自日本的菌株接合酵母属(Zygosaccharomyces sp.)IFO 11066的同义词。
以下实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容据此以引用方式并入，特别是WO2020/141168、WO2019/058001、WO2019/057999、WO2008/042338、WO2019/058000、WO2006/102342、WO2017/115322、WO2017/211930。
实施例
实施例1：一般方法和菌株
本文所述的所有基本分子生物学和DNA操作程序通常根据Sambrook等人(编辑)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press:NewYork(1989)或Ausubel等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology.Wiley:NewYork(1998)进行。
摇板测定。通常，用10μl新鲜生长的耶氏酵母接种200μl的0.25％酵母提取物、0.5％蛋白胨(0.25X YP)，并用200μl矿物油(Drakeol 5,Penreco,Karns City,PA,USA)覆盖。将重悬于PBS中的脂肪酶添加到生长培养基中。碳源是2％玉米油的矿物油溶液。通过划线至单菌落来纯化转化体，在24孔板中在振荡培养箱(Infors Multitron，30℃，800RPM)中在上述培养基中在30℃下生长4天。从振荡板孔中取出第二相(Drakeol 5)级分，并通过UPLC在正相柱和/或C4 HPLC上用光电二极管阵列检测器进行分析(见下文详述)。
DNA转化。通过在YPD板培养基上过夜生长来转化菌株；从板上刮下50μl细胞并通过在40℃下与1μg转化DNA(通常为用于整合转化的线性DNA)、40％ PEG 3550MW、100mM乙酸锂、50mM二硫苏糖醇、5mM Tris-Cl pH 8.0、0.5mM EDTA一起在500μl中温育30分钟来转化，并直接铺板到选择性培养基上或者在显性抗生素标记物选择的情况下，在铺板到选择性培养基上之前，将细胞在YPD液体培养基上在30℃生长4小时。使用5-氟乳清酸(FOA)进行URA3标记物再循环。游离型潮霉素抗性标记物(Hyg)质粒通过在非选择性培养基上传代而固化，通过将菌落从非选择性培养基复制铺板到含有潮霉素的培养基(100μg/mL)上来鉴定Hyg敏感性菌落。在含有诺尔丝菌素(100μg/mL)的YPD培养基上进行诺尔丝菌素抗性标记物(Nat)的选择。
DNA分子生物学。在Genscript(Piscataway,NJ,USA)处合成含有用于DrBCO、LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L和FfRDH(SEQ ID NO:14)的表达系统的质粒MB9523以及用于表达嵌合YlLIP2pre-CrLIP1蛋白(SEQ ID NO:16)的MB9721(SEQ IDNO:15)。质粒MB9523和MB9721均含有用于在解脂耶氏酵母转化中进行标记物选择的‘URA3’。为了通过基因和标记物HindIII/XbaI(MB9721)或SfiI(MB9523)的随机非同源末端连接进行干净的基因插入，通过凝胶电泳和Qiagen凝胶纯化柱纯化目的质粒片段。通过测序验证克隆。通常，基因通过合成生物学在GenScript(Piscataway,NJ)处合成。在Genscript(Piscataway,NJ,USA)处合成含有Cas9和引导RNA表达系统的质粒MB9287和MB9953，该引导RNA表达系统在MB9287的情况下靶向LIP2、LIP3和LIP8，并且在MB9953的情况下靶向LIP4。
质粒列表。所用的质粒、菌株、核苷酸和氨基酸序列列于表1、表2、表3和序列表中。通常，本文提及的所有未修饰序列与参考菌株CLIB122的数据库中的登录序列相同(DujonB等人，Nature.2004年7月1日；430(6995):35-44)。
表1：用于构建菌株以过表达或缺失相应基因(表示为“插入物”)的质粒列表。“LmATF1-mut”是指携带aa取代S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L的米拉氏拉茜斯酵母(LmATF1；WO2019/058001中的SEQ ID NO:13)。“DrBCO”是指源自斑马鱼的BCO(参见WO2020/141168中的SEQ ID NO:18)；“FfRDH”是指源自藤仓镰刀菌的RDH(参见WO2020/141168中的SEQ IDNO:22)。更多解释参见文本。
表2：所用解脂耶氏酵母菌株的列表。ML17544的构建描述于WO2020/141168的表2中。更多详细信息参见文本。
表3：使用Cas9 CRISPR靶向的DNA序列用于脂肪酶基因的突变。“Lip基因”意指来自解脂耶氏酵母的相应脂肪酶基因。“CRISPR靶向序列”是用于Cas9 CRISPR靶向的种子序列。用于LIP8、LIP2和LIP3构建体的相应引导RNA表达质粒是MB9287，对于LIP4是MB9953。更多详细信息参见文本。
类视黄醇定量。用C4反相类视黄醇方法(见下文)和如其他所述的C18(WO2020/141168)进行类视黄醇的分析。所有添加的中间体的添加得到类视黄醇的总量。
C4反相色谱法。为了准确测定不连续的类视黄醇，使用长程反相系统。我们通过Agilent 1290仪器在230nm和325nm下分离分析物，该仪器具有YMC Pro C4，150×3.0mm 3μm柱(YMC America,Allentown PA)固定相，和5μl进样环体积，以及控制在23℃的柱和样品盘，梯度如表4B中所述。在230nm和325nm检测分析物，并用LCMS验证峰身份。分析物分离为根据表4A指定的离散峰。
表4A：使用C4-反相方法的分析物列表。所有添加的中间体的添加得到类视黄醇的总量。“RT”意指保留时间。更多详细信息参见文本。
表4B：具有如下的UPLC方法梯度：溶剂A：乙腈；溶剂B：水；溶剂C：水/乙腈/甲磺酸1000:25:1。更多详细信息参见文本。
方法校准。使用获自DSM Nutritional Products,Kaiseraugst,CH的高纯度视黄醇乙酸酯来校准方法。针对视黄醇乙酸酯定量视黄醇和视黄醛。如下制备表4C中所述的稀释液。称取40mg视黄醇乙酸酯到100mL容量瓶中，并溶解在乙醇中，得到400μg/mL溶液。根据需要对该溶液进行超声处理以确保溶解。使用50/50甲醇/甲基叔丁基醚(MTBE)作为稀释剂，将5mL该400μg/mL溶液稀释至50mL(1/10稀释度，终浓度40μg/mL)，5mL稀释至100mL(1/20稀释度，终浓度20μg/mL)，5mL 40μg/mL稀释至50mL(1/10稀释度，终浓度4μg/mL)，5mL 20μg/mL稀释至50mL(1/10稀释度，2μg/mL)。所有稀释均在容量瓶中进行。通过在乙醇中将400μg/mL储备溶液进一步稀释100倍(使用2mL容量移液管和200mL容量瓶)来确定视黄醇乙酸酯的纯度。将该溶液在325nm下使用乙醇的吸光度作为空白，使用等式(Abs*稀释度(100)*分子量(328.5)/51180＝浓度(以mg/mL计))调节初始浓度。由于视黄醇乙酸酯的UV吸光度快速超最大化，因此，较低的浓度更好。
表4C：校准标准品的制备。更多解释参见文本。
样品制备。将来自每种菌株的顶部第二相层样品以25倍或更高的稀释度稀释到四氢呋喃(THF)中。使用2mL Precellys(Bertin Corp,Rockville,MD)管制备发酵全发酵液，添加25μl充分混合的发酵液和975μl THF。Precellys以3x15x7500 rpm进行两个循环，循环之间在-80℃冷冻10分钟。经由以13000rpm离心1分钟沉淀细胞碎片。将这些样品在THF中稀释10倍。
实施例2：解脂耶氏酵母中脂肪酶基因的缺失
使用现代CRISPR Cas9方法，使用表3中所示的CRISPR位点在菌株ML18812中使脂肪酶基因(LIP2、LIP3和LIP8)失活，以产生菌株ML18743。简而言之，用含有用于Cas9的表达模块和诺尔丝菌素选择标志物的MB7452(SEQ ID NO:14)转化菌株ML18812。随后用质粒MB9287转化诺尔丝菌素抗性转化体(在YPD上用200μg/mL诺尔丝菌素选择)，该质粒含有用于Cas9的表达序列和具有靶向LIP2、LIP3和LIP8的种子序列的引导RNA(示于表3中)以及潮霉素抗性标志物。通过Sanger测序，用靶向区域侧翼的引物筛选转化体(在YPD上用200μg/mL潮霉素选择)的突变。发现菌株ML18743在LIP2、LIP3和LIP8中具有失活突变。尽管使用在玉米油上生长的此类菌株的FARE形成可或多或少地被消除，但与菌株ML18812相比，此类脂肪酶缺失菌株的生长速率非常低(参见表6)。
实施例3：在解脂耶氏酵母的生长缺陷型LIP2-3-8缺失菌株中添加异源脂肪酶
为了校正低生长速率的缺陷(参见实施例2)，将可商购获得的来自皱褶假丝酵母(CrLIP Sigma)、柱状假丝酵母(CcLIP，Creative Enzymes)、雪白根酶(RnLIP，Sigma)和米根霉(RoLIP，Creative enzymes)的脂肪酶以及来自DSM的脂肪酶(CrLIP1、CrLIP2、CrLIP3、CrLIP4和CrLIP5)添加到接种到具有2％玉米油作为唯一碳源的0.25xYEP培养基中的菌株ML18743(包含lip2-3-8缺失)中(表5)。
商业生产的Cc和Cr脂肪酶制剂(Creative Enzymes和Sigma Aldrich)通常是由皱褶假丝酵母/柱状假丝酵母天然表达的几种脂肪酶的混合物。来自DSM的脂肪酶通过根据WO2017/115322中实施例1的方案生产。
表5：将异源脂肪酶添加到发酵培养基中。给出了目录号或SEQ ID NO:(对于来自DSM的脂肪酶)。更多解释参见文本。
尽管所有酶都能够分解玉米油中的甘油三酯以允许生长，但只有CrLip、CcLip、RnLIP、RoLIP、CrLIP1、CrLIP2和CrLIP5能够在产生lip2、lip3、lip8视黄醇乙酸酯的菌株ML18743中产生最少的FARE。结果示于表6中。
表6：在添加或不添加根据表5的相应脂肪酶的情况下与作为对照的野生型菌株ML18812(“LIP+”)相比菌株ML18743(LIP2-3-8缺失)中的类视黄醇产生。“％FARE”是基于添加每种单独的脂肪酶产生的总类视黄醇。“总类视黄醇(LIP+的％)”是与未添加脂肪酶的对照中的总类视黄醇相比产生的类视黄醇的百分比，其中将用对照获得的总类视黄醇设定为100％。对于在玉米油上的生长，“+++”表示上四分位数生长，而“+”表示下四分位数生长。更多解释参见文本。
根据该数据，我们推断CrLip1能够同时实现生长/类视黄醇产生，同时使FARE的产生最小化，并且最能反映观察到的可商购获得的脂肪酶例如CrLIP、CcLIP、RoLIP或RnLIP的行为(参见表6)。
实施例4：在解脂耶氏酵母的生长缺陷型LIP2-3-8缺失菌株中添加CrLIP1突变体
产生了几种突变CrLIP1蛋白(对于在巴斯德毕赤酵母中产生这些突变体的完整描述，参见WO2017/211930中的实施例1和2)，包括双突变体，并在我们的摇板测定中测试。结果示于表7中。与WT CrLIP1相比，这些CrLIP1突变体中的一些突变体具有减少的FARE，而没有严重减少总类视黄醇产生。
表7：在添加或不添加所示的CrLIP1的相应突变体的情况下与作为对照的野生型菌株ML18812(“LIP+”)相比菌株ML18743(LIP2-3-8缺失)中的类视黄醇产生。“％FARE”是基于添加每种单独的脂肪酶产生的总类视黄醇。“总类视黄醇(LIP+的％)”是与未添加脂肪酶的对照中的总类视黄醇相比产生的类视黄醇的百分比，其中将用对照获得的总类视黄醇设定为100％。更多解释参见文本。
实施例5：在解脂耶氏酵母的生长缺陷型LIP2-3-8缺失菌株中添加异源CrLIP嵌合体
为了确定CrLIP1的表达是否能弥补菌株ML18756的玉米油利用缺陷，我们用编码由解脂耶氏酵母LIP2分泌信号和皱褶假丝酵母LIP1(CrLIP1)酶组成的嵌合融合蛋白(SEQID NO:24)的MB9721(SEQ ID NO:16)转化它。该菌株称为ML18870。转化体能够在玉米油上生长，并产生表8所示的类视黄醇。菌株ML18870能够在不添加脂肪酶的情况下提高总类视黄醇产量，同时保持如ML18812中所见的减少的FARE。
表8：与添加纯化的Cr脂肪酶1(CrLIP1)相比以及与作为对照的野生型菌株ML18812(“LIP+”)相比在玉米油上生长的YlLIP2(pre)-CrLIP1嵌合体(菌株ML18870)的表达。“％FARE”是基于添加所示的相应脂肪酶产生的总类视黄醇。“总类视黄醇(CrLIP1的％)”是与添加Cr脂肪酶1的总类视黄醇相比产生的类视黄醇的百分比，其中将用CrLIP1获得的总类视黄醇设定为100％。
更多解释参见文本。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司（DSM IP Assets B.V.）
<120>脂肪酸视黄酯形成的减少
<130>Case 33798
<160>24
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>334
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400>1
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 1015
Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys
202530
Arg Val Tyr Thr Ser Thr Glu Thr Ser His Ile Asp Gln Glu Ser Tyr
354045
Asn Phe Phe Glu Lys Tyr Ala Arg Leu Ala Asn Ile Gly Tyr Cys Val
505560
Gly Pro Gly Thr Lys Ile Phe Lys Pro Phe Asn Cys Gly Leu Gln Cys
65707580
Ala His Phe Pro Asn Val Glu Leu Ile Glu Glu Phe His Asp Pro Arg
859095
Leu Ile Phe Asp Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Asp His Ala Ser Lys
100 105 110
Gln Ile Tyr Leu Val Ile Arg Gly Thr His Ser Leu Glu Asp Val Ile
115 120 125
Thr Asp Ile Arg Ile Met Gln Ala Pro Leu Thr Asn Phe Asp Leu Ala
130 135 140
Ala Asn Ile Ser Ser Thr Ala Thr Cys Asp Asp Cys Leu Val His Asn
145 150 155 160
Gly Phe Ile Gln Ser Tyr Asn Asn Thr Tyr Asn Gln Ile Gly Pro Lys
165 170 175
Leu Asp Ser Val Ile Glu Gln Tyr Pro Asp Tyr Gln Ile Ala Val Thr
180 185 190
Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ala Ala Leu Leu Phe Gly Ile Asn Leu
195 200 205
Lys Val Asn Gly His Asp Pro Leu Val Val Thr Leu Gly Gln Pro Ile
210 215 220
Val Gly Asn Ala Gly Phe Ala Asn Trp Val Asp Lys Leu Phe Phe Gly
225 230 235 240
Gln Glu Asn Pro Asp Val Ser Lys Val Ser Lys Asp Arg Lys Leu Tyr
245 250 255
Arg Ile Thr His Arg Gly Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Phe Trp Asp
260 265 270
Gly Tyr Gln His Cys Ser Gly Glu Val Phe Ile Asp Trp Pro Leu Ile
275 280 285
His Pro Pro Leu Ser Asn Val Val Met Cys Gln Gly Gln Ser Asn Lys
290 295 300
Gln Cys Ser Ala Gly Asn Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Val Ile Gly
305 310 315 320
Asn His Leu Gln Tyr Phe Val Thr Glu Gly Val Cys Gly Ile
325 330
<210>2
<211>1005
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>2
atgaagcttt ccaccatcct cttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc60
cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag tgtacacctc taccgagacc 120
tctcacattg accaggagtc ctacaacttc tttgagaagt acgcccgact cgcaaacatt 180
ggatattgtg ttggtcccgg cactaagatc ttcaagccct tcaactgtgg cctgcaatgt 240
gcccacttcc ccaacgttga gctcatcgag gagttccacg acccccgtct catctttgat 300
gtttctggtt acctcgctgt tgatcatgcc tccaagcaga tctaccttgt tattcgagga 360
acccactctc tggaggacgt cataaccgac atccgaatca tgcaggctcc tctgacgaac 420
tttgatcttg ctgctaacat ctcttctact gctacttgtg atgactgtct tgtccacaat 480
ggcttcatcc agtcctacaa caacacctac aatcagatcg gccccaagct cgactctgtg 540
attgagcagt atcccgacta ccagattgct gtcaccggtc actctctcgg aggagctgca 600
gcccttctgt tcggaatcaa cctcaaggtt aacggccacg atcccctcgt tgttactctt 660
ggtcagccca ttgtcggtaa cgctggcttt gctaactggg tcgataaact cttctttggc 720
caggagaacc ccgatgtctc caaggtgtcc aaagaccgaa agctctaccg aatcacccac 780
cgaggagata tcgtccctca agtgcccttc tgggacggtt accagcactg ctctggtgag 840
gtctttattg actggcccct gatccaccct cctctctcca acgttgtcat gtgccagggc 900
cagagcaata aacagtgctc tgccggtaac actctgctcc agcaggtcaa tgtgattgga 960
aaccatctgc agtacttcgt caccgagggt gtctgtggta tctaa1005
<210>3
<211>498
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>3
Met Pro Leu Glu Leu Pro Ser Leu Asn Ala Ser Ile Val Gly Asn Thr
1 5 1015
Val Gln Asn Gly Ala Val Glu Gln Phe Leu Asn Ile Arg Tyr Ala Asp
202530
Ile Pro Gly Lys Phe Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Asp Trp Asn Gly
354045
Ala Glu Ile Asp Ala Thr Lys Val Gly Pro Val Cys Pro Gln Pro Arg
505560
Thr Pro Phe Asn Phe Phe Ser Val Pro Asp Asp Leu Trp Glu Lys Val
65707580
Asn Val Asp Thr Tyr Gln Asp Gly Leu Leu Cys Asp Asn Leu Ile Val
859095
Thr Arg Pro Lys Gly Val Ser Ala Asn Ala Arg Leu Pro Thr Val Val
100 105 110
Trp Ile His Gly Gly Ser Asn Ile Glu Gly Ser Ile Tyr Asn Leu Ile
115 120 125
Tyr Glu Pro Gln Phe Leu Val Ala Glu Ser Val Arg Val Gly Lys Pro
130 135 140
Ile Val His Val Cys Ile Glu Tyr Arg Leu Gly Leu Ala Gly Phe Leu
145 150 155 160
Thr Lys Asn Gly Lys Gly Asn Trp Gly Thr Trp Asp Gln Tyr Thr Gly
165 170 175
Cys Gln Trp Val Asn Arg His Ile Gln Asp Phe Gly Gly Asp Pro Leu
180 185 190
Asn Val Thr Leu Thr Gly Glu Ser Ala Gly Ser Val Ala Val His Asn
195 200 205
Met Leu Ile Lys Asp Ser Met Asn Gly Arg Lys Leu Phe Arg Asn Ala
210 215 220
Val Met Met Ser Gly Thr Leu Glu Thr Ile Thr Pro Gln Pro Pro Lys
225 230 235 240
Trp His Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Ala Lys Val Thr Gly Lys Glu
245 250 255
Val Ala Asp Leu Ala Ser Leu Ser Asp Lys Glu Leu Leu Asp Ala Gln
260 265 270
Ile Lys Leu Asn Val Ala Val Cys Met Thr Cys Asp Asp Gly Asp Phe
275 280 285
Phe Glu Pro Gly Trp Lys Gln His Leu Thr Pro Asp Trp Leu Asp Lys
290 295 300
Leu Ile Ile Ser Asp Cys Lys Asp Glu Gly Met Leu Tyr Phe Leu Pro
305 310 315 320
Val Asn Ala Gln Asp Asp Glu Glu Leu Leu Ala Lys Val Ala Lys Ser
325 330 335
Pro Val Gly Lys Glu Ile Ser Glu Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Gly Gly
340 345 350
Asp Ile Lys Ser Ala Cys Leu Asp Leu Lys Thr Asp Ala Thr Phe Asn
355 360 365
Tyr Phe Asn His Leu Leu Phe Lys Lys Met Glu Glu Ala Arg Asn Asn
370 375 380
Gly Ser Thr Ser Arg Val Tyr Arg Leu Ala Val Asp Glu Pro Asn Pro
385 390 395 400
His Asn Pro Asp Gln Arg Ala His His Ala Val Asp Val Leu Tyr Met
405 410 415
Phe Asn Ser Thr Lys Phe Asn Glu His Gly Asp Lys Leu Ser Arg Leu
420 425 430
Phe Gln Ser His Phe Leu Arg Leu Ala Tyr Gly Leu Glu Pro Trp Asp
435 440 445
His Arg Asn Phe Gly Val Tyr Arg Asn Gly Gly Tyr Gln Gln Leu Pro
450 455 460
Leu Ser Glu Leu Asn Lys Val Arg Pro Val Glu Arg Tyr Glu Ala Leu
465 470 475 480
Ser Lys Met Asp Phe Gly Gln Val Gly Arg Leu Ser Asn Ala Leu Ser
485 490 495
Arg Leu
<210>4
<211>1497
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>4
atgcctctcg aactcccctc gctcaacgcc tcgattgtcg gcaacaccgt tcagaacggc60
gctgttgagc agtttctcaa catccgatac gccgacattc ctggcaagtt tgagaagccc 120
gtgctcaaga acgattggaa cggcgcggag atcgacgcca ccaaggtcgg tcccgtgtgc 180
ccccaacccc gcaccccatt caacttcttc tccgtgccag acgacctctg ggagaaagtc 240
aatgtggaca cgtaccagga cggtctgctg tgcgacaacc tgattgtgac gcgaccgaag 300
ggcgtgtctg ccaacgcccg gctgcccact gttgtgtgga tccacggcgg ctccaatatt 360
gagggcagta tctacaacct catctatgag ccccagttcc tggtggcaga gtcggtgcga 420
gtaggcaagc cgattgtgca cgtgtgtatc gagtaccgac tgggtctcgc gggcttcctc 480
accaagaacg gcaagggcaa ctggggcacg tgggatcagt acacgggctg ccagtgggtc 540
aaccgccaca ttcaggactt tggaggcgat cctttgaacg tgacattgac cggtgagtct 600
gccggctctg tagcagtcca taacatgctc atcaaggact ccatgaacgg ccgaaagttg 660
ttccgaaatg ccgtcatgat gagtggcact ctcgagacca tcactcctca gcctcccaag 720
tggcatgctc gtttggagga gaaggtggcc aaggtcactg gcaaggaagt ggccgacctt 780
gcttctctgt ccgataagga gctgctcgac gcccagatca agctcaatgt ggctgtgtgc 840
atgacttgcg acgacggcga ctttttcgag cccggatgga agcagcatct gactcctgac 900
tggctcgaca agctcatcat ctccgattgc aaggacgagg gcatgctgta tttcctgcca 960
gtcaacgcgc aggacgacga ggagctgttg gcaaaggtgg ccaagtcgcc cgtgggtaag1020
gagatttccg agctttacgg catcaaggag ggtggcgata tcaagtctgc gtgtctcgat1080
ctcaagactg acgccacctt caattacttt aaccatctgc tgttcaagaa gatggaggag1140
gcccgaaaca acggctccac ttctcgagtt taccgtctgg ccgtcgatga gcccaacccc1200
cacaaccccg accagcgggc ccaccacgcc gtcgacgtgc tgtacatgtt caactcgacc1260
aagttcaacg agcacggcga caagctgtct cggctgttcc agagccactt tttgcggctg1320
gcgtatggcc tggagccctg ggaccatcga aactttggag tgtacagaaa cggcggctac1380
cagcagctgc cgctgagtga gttgaacaag gtccgacccg tcgagcggta cgaggcgctg1440
tccaagatgg actttggcca ggttgggcgt ttgtccaatg cgctttcgcg cctatga 1497
<210>5
<211>371
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>5
Met Val Ser Leu Ser Ala Arg Ile Lys Asp Phe Phe Ser Val Leu Leu
1 5 1015
Leu Gly Ala Ala Thr Ile Thr Pro Ser Thr Gln Thr Ala Gly Val Ser
202530
Gln Gly Phe Tyr Asp Phe Ala Arg Asp Phe Ala His Leu Ser Asn Ile
354045
Ala Tyr Cys Val Asn Ala Pro Ile Thr Pro Leu Asn Pro Asp Phe Thr
505560
Cys Gly Asn Ser Cys Lys His Phe Pro Glu Ile Glu Leu Val Lys Thr
65707580
Phe Gly Gly Asn Phe Phe Lys Thr Ser Ile Thr Gly Tyr Leu Ala Val
859095
Asp His Val Lys Lys Glu Lys Tyr Val Val Phe Arg Gly Thr Phe Ser
100 105 110
Leu Ala Asp Ala Ile Thr Asp Met Gln Phe Gln Leu Ser Pro Phe Leu
115 120 125
Val Asp Val Pro Ala Leu Asn Thr Phe Ser Ala Asn Asp Thr Thr Ala
130 135 140
Glu Ala Gln Thr His Cys Glu Gly Cys Lys Ile His Asp Gly Phe Ser
145 150 155 160
Lys Ala Phe Thr Glu Thr Trp Gly Asn Ile Gly Glu Asp Leu Gln Lys
165 170 175
His Leu Asp Ala Asn Pro Asp Tyr Gln Leu Tyr Val Thr Gly His Ser
180 185 190
Leu Gly Ala Ala Met Ala Leu Leu Gly Ala Thr Ser Ile Lys Leu Lys
195 200 205
Gly Tyr Asp Pro Ile Leu Ile Asn Tyr Gly Gln Pro Arg Val Gly Asn
210 215 220
Lys Pro Phe Ala Glu Phe Ile Asn Lys Leu Trp Phe Gly Glu Gly Asn
225 230 235 240
Gly Leu Glu Ile Thr Pro Glu Arg Lys Leu Tyr Arg Met Thr His Trp
245 250 255
Asn Asp Ile Phe Val Gly Leu Pro Asn Trp Glu Gly Tyr Thr His Ser
260 265 270
Asn Gly Glu Val Tyr Ile Asn Asn Arg Phe Ile Asn Pro Pro Leu Lys
275 280 285
Asp Val Ile Ser Cys Ala Gly Gly Glu Asn Ser Lys Cys Tyr Arg Ser
290 295 300
Ser Phe Ser Leu Leu Ser Gln Ile Asn Leu Leu Gln Asn His Leu Ala
305 310 315 320
Tyr Ile Asp Tyr Ile Gly Tyr Cys Ala Leu Asn Ile Gly Arg Arg Glu
325 330 335
Leu Ala Asp Gln Glu His Tyr Thr Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gly His Arg
340 345 350
Ser Glu Glu Asp Phe Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Ser Thr Pro Gln
355 360 365
Val Glu Asn
370
<210>6
<211>1116
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>6
atggtatccc tctctgctcg aatcaaagac tttttttcgg tcctcctcct cggagctgca60
accatcactc cctccacaca gaccgcaggc gtgtctcaag ggttctatga ttttgctcgg 120
gactttgccc atctgtccaa cattgcctac tgtgtcaatg ctcccatcac tccactgaac 180
ccggacttca cctgtggcaa ctcgtgcaag cactttccgg aaattgagct tgtgaagaca 240
tttggaggca acttcttcaa gacctccatt acgggctacc tggctgtcga tcatgtcaag 300
aaggagaagt acgttgtctt ccgaggaacc ttttcgctgg cagacgcgat cacggacatg 360
cagttccagc tgtctccttt cctggtcgat gtgcctgccc tgaacacttt ctcagctaat 420
gacaccaccg cagaggccca gacgcactgt gagggctgca aaattcacga cggcttctcc 480
aaggccttta ccgagacctg gggtaacatt ggtgaggatc tgcagaaaca cctggacgct 540
aacccggact accagctgta cgtgactggc cattctctgg gagctgctat ggcccttctt 600
ggagctactt ccatcaagct caagggctac gatcccattc tcatcaacta cggacagccc 660
cgagtcggaa acaagccctt cgctgagttc attaacaagt tgtggtttgg agaaggcaac 720
ggtctggaaa tcacccccga gagaaagctg taccgaatga cccactggaa cgacatcttt 780
gttggcctgc ccaactggga gggatacacc cactctaacg gtgaagtata catcaacaac 840
cggttcatca accctcctct caaggatgtc atctcttgtg ctggaggcga aaactcgaag 900
tgctaccgat cctcgttcag cctgctgtcc cagatcaatc tgctccaaaa ccacctggct 960
tacattgatt acattggata ctgcgctctg aacattggtc gacgagagct tgccgatcag1020
gaacattaca ctggtcctta ttactatggt catcgatctg aggaggactt taagaagttg1080
ggcttggagc tatccacccc acaagttgag aactga1116
<210>7
<211>406
<212>PRT
<213>解脂耶氏酵母
<400>7
Met Ala Gly Phe Asn Phe Thr Phe Gly Gln Val Ile Ser Tyr Leu Ala
1 5 1015
Ser Met Leu Tyr Gly Gln Val Asp Ala Thr Ser Ser Ser Thr Arg Ile
202530
Gln Ala Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Phe Thr Ala Lys Phe Ser Arg Leu
354045
Ser Asn Ile Ala Tyr Cys Ile Asn Ala Pro Phe Thr Pro Leu Arg Thr
505560
Asp Phe Thr Cys Gly Glu Ser Cys Arg Tyr Phe Pro Asp Leu Gln Leu
65707580
Asp Ser Val Phe Gly Gly Asn Phe Ser Ser Ala Ser Thr Thr Gly Tyr
859095
Ile Ala Tyr Asp His Lys Lys Lys Glu Lys Tyr Ile Val Phe Arg Gly
100 105 110
Thr Phe Ser Ile Pro Asp Ile Ile Thr Asp Ile Gln Phe Gln Thr Ala
115 120 125
Pro Trp Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Leu Ile Pro Thr Lys Glu Asp
130 135 140
Phe Glu His Lys Gln Ala Ile Leu Lys His Tyr Ala Ala Glu Asn Lys
145 150 155 160
Gly Leu Ser Asn Leu Glu Glu Arg Gln Asp Val Val His Glu Asp Pro
165 170 175
Ser Leu Val Pro Lys Lys Met Asp Lys Cys Glu Asn Cys Gln Ile His
180 185 190
Asp Gly Phe Ala Lys Gly Phe Asn Glu Thr Ile Glu His Ala Gly Pro
195 200 205
Gln Ile Glu Lys Phe Leu Gly Asn Asn Thr Asp Tyr Lys Met Phe Val
210 215 220
Val Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Gln Ala Gln Leu Phe Ala Thr Gln
225 230 235 240
Phe Lys Leu Leu Gly Phe Asp Pro Tyr Met Ile Asn Phe Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Leu Gly Asn Pro Glu Phe Ala Ala Tyr Ile Asn Gln Leu Trp Phe
260 265 270
Asn Asp Thr Gly Leu Val Val Asn Asp Ala Arg Arg Phe Tyr Arg Val
275 280 285
Thr His Trp Asn Asp Ile Val Val Gly Val Pro Asp Trp Leu Asn Tyr
290 295 300
Thr His Ser Ile Gly Glu Val Phe Ile Asp Glu Glu Ser Val Tyr Pro
305 310 315 320
Lys Leu Asp Lys Val Val Val Cys Glu Gly Gly Glu Asn Pro Leu Cys
325 330 335
His Arg Gly Thr Phe Asn Leu Trp Ser Arg Ile Asn Phe Leu Gln Asn
340 345 350
His Leu Ala Tyr Ile Phe Tyr Ile Gly Leu Cys Ala Phe Asn Ile Gly
355 360 365
Arg Arg Asp Val Leu Asn Met Pro Gln Tyr Gln Gly Asn Phe Ser Tyr
370 375 380
Gln His Asn Ile Asp Pro Asn Tyr Asn Tyr Asp Thr Lys Val Pro Thr
385 390 395 400
Arg Ile Ser Lys Ser Asn
405
<210>8
<211>1221
<212>DNA
<213>解脂耶氏酵母
<400>8
atggcagggt tcaacttcac tttcgggcag gtgatttcgt acctggcttc catgctctat60
ggacaggtgg atgccacttc atcctccact cgaatccagg ccacccagga tctgtacgac 120
ttcacagcca agttttcgcg actctcaaac atcgcgtact gcatcaatgc ccccttcacg 180
cctctcagaa cggacttcac ctgcggagaa agctgtcggt acttccccga cctccagctg 240
gactcagtgt ttggtggtaa cttctcctca gcctccacta ccggctacat tgcatacgac 300
cacaagaaga aggaaaagta cattgtgttt cgaggaactt tcagtatccc tgatatcatc 360
acagacattc aatttcagac tgccccttgg ttgacctctc tgcccacgca tctgatccct 420
accaaggagg actttgaaca caagcaggcc atcctgaagc actacgctgc cgaaaacaag 480
ggtctcagca acctggaaga gcgacaggat gttgtgcatg aagaccctag cctggttccc 540
aagaaaatgg acaagtgcga gaactgccag atccatgacg gattcgccaa gggcttcaac 600
gagactatcg agcatgccgg accccagatt gaaaagttcc tgggcaataa caccgactac 660
aagatgtttg ttgttggcca ctctctagga gctgctcagg cccagctgtt tgctacacag 720
ttcaaactgc tgggatttga cccttacatg atcaactttg gacagcctcg acttggaaac 780
cctgagttcg ccgcctacat caaccagctg tggttcaacg atactggtct ggttgtcaat 840
gatgcccgac gattctaccg agtgactcac tggaacgata tcgtcgtggg agtgcccgac 900
tggctcaatt acacccactc tatcggagag gtgttcatag acgaggagag cgtttacccc 960
aagctggaca aggtggtggt gtgcgaggga ggagagaacc ccctgtgcca ccgaggaact1020
ttcaacctgt ggtcacgaat caacttcctg cagaaccatt tggcttatat cttctacatt1080
ggtctgtgtg ctttcaacat tggccgaaga gacgtgctca acatgccaca ataccagggc1140
aacttctcgt accagcacaa catcgacccc aactacaatt acgataccaa ggttcccacc1200
cggatcagta aatcaaacta a1221
<210>9
<211>535
<212>PRT
<213>皱褶假丝酵母（Candida rugosa）
<400>9
Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn
1 5 1015
Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro
202530
Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser Leu
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Asp Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln Asn
505560
Pro Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp Leu
65707580
Val Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu Asp
859095
Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ala
100 105 110
Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Gly
115 120 125
Gly Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile Ala
130 135 140
Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Pro Val Val Ser
145 150 155 160
Ser Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala
165 170 175
Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp
180 185 190
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly
195 200 205
Glu Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp
210 215 220
Gly Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met
225 230 235 240
Gln Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly
245 250 255
Asn Glu Ile Phe Asp Leu Leu Ala Ser Asn Ala Gly Cys Gly Ser Ala
260 265 270
Ser Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu
275 280 285
Asp Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg
290 295 300
Leu Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met
305 310 315 320
Tyr Ala Leu Val Arg Glu Gly Lys Tyr Ala Asn Ile Pro Val Ile Ile
325 330 335
Gly Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Phe Phe Gly Thr Ser Ser Leu Asn
340 345 350
Val Thr Thr Asp Ala Gln Ala Arg Glu Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Val
355 360 365
His Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Thr Ala Tyr Pro Gly
370 375 380
Asp Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu
385 390 395 400
Thr Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Val Leu Gly Asp Leu Gly Phe
405 410 415
Thr Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys
420 425 430
Tyr Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr
435 440 445
Phe His Ser Asn Asp Ile Val Phe Gln Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Leu Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp
465 470 475 480
Pro Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser
485 490 495
Ser Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr
500 505 510
Thr Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser
515 520 525
Asn Pro Pro Ser Phe Phe Val
530 535
<210>10
<211>534
<212>PRT
<213>皱褶假丝酵母
<400>10
Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu Asn
1 5 1015
Ala Ile Val Asn Glu Lys Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro
202530
Val Gly Thr Leu Arg Phe Lys Pro Pro Val Pro Tyr Ser Ala Ser Leu
354045
Asn Gly Gln Gln Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Met Asn
505560
Pro Met Gly Ser Phe Glu Asp Thr Leu Pro Lys Asn Ala Arg His Leu
65707580
Val Leu Gln Ser Lys Ile Phe Gln Val Val Leu Pro Asn Asp Glu Asp
859095
Cys Leu Thr Ile Asn Val Ile Arg Pro Pro Gly Thr Arg Ala Ser Ala
100 105 110
Gly Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Leu Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Leu Phe Pro Gly Asp Gln Met Val Ala Lys Ser Val Leu
130 135 140
Met Gly Lys Pro Val Ile His Val Ser Met Asn Tyr Arg Val Ala Ser
145 150 155 160
Trp Gly Phe Leu Ala Gly Pro Asp Ile Gln Asn Glu Gly Ser Gly Asn
165 170 175
Ala Gly Leu His Asp Gln Arg Leu Ala Met Gln Trp Val Ala Asp Asn
180 185 190
Ile Ala Gly Phe Gly Gly Asp Pro Ser Lys Val Thr Ile Tyr Gly Glu
195 200 205
Ser Ala Gly Ser Met Ser Thr Phe Val His Leu Val Trp Asn Asp Gly
210 215 220
Asp Asn Thr Tyr Asn Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Ala Ile Met Gln
225 230 235 240
Ser Gly Cys Met Val Pro Ser Asp Pro Val Asp Gly Thr Tyr Gly Thr
245 250 255
Glu Ile Tyr Asn Gln Val Val Ala Ser Ala Gly Cys Gly Ser Ala Ser
260 265 270
Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Leu Ser Gln Asp Thr Leu Tyr Gln
275 280 285
Ala Thr Ser Asp Thr Pro Gly Val Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Arg Leu
290 295 300
Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Thr Phe Ile Thr Asp Asp Met Tyr
305 310 315 320
Ala Leu Val Arg Asp Gly Lys Tyr Ala His Val Pro Val Ile Ile Gly
325 330 335
Asp Gln Asn Asp Glu Gly Thr Leu Phe Gly Leu Ser Ser Leu Asn Val
340 345 350
Thr Thr Asp Ala Gln Ala Arg Ala Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Ile His
355 360 365
Ala Ser Asp Ala Glu Ile Asp Thr Leu Met Ala Ala Tyr Thr Ser Asp
370 375 380
Ile Thr Gln Gly Ser Pro Phe Asp Thr Gly Ile Phe Asn Ala Ile Thr
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Pro Gln Phe Lys Arg Ile Ser Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ala Phe Thr
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Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn Tyr Tyr Gln Gly Gly Thr Lys Tyr
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Ser Phe Leu Ser Lys Gln Leu Ser Gly Leu Pro Val Leu Gly Thr Phe
435 440 445
His Gly Asn Asp Ile Ile Trp Gln Asp Tyr Leu Val Gly Ser Gly Ser
450 455 460
Val Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Asn Asp Leu Asp Pro
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Asn Lys Ala Gly Leu Trp Thr Asn Trp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Ser
485 490 495
Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Gln Ile Asn Gly Leu Gly Leu Tyr Thr
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Pro Pro Ser Phe Phe Val
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<211>534
<212>PRT
<213>皱褶假丝酵母
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有Cas9的质粒
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aacaaaataa acaaaaacaa aataaatata taactaccag tatctgacta aaagttcaaa2280
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attttattta ataaaagaaa acaacaagat gggctcaaaa ctttcaactt atacgataca2460
taccaaataa caatttagta tttatctaag tgcttttcgt agataatgga atacaaatgg2520
atatccagag tatacacatg gatagtatac actgacacga caattctgta tctctttatg2580
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aacttttgca gattacctaa tttggtaaga tattaattat gaactgaaag ttgatggcat2700
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gactccatcg acaacaaggt tctgacccga tctgacaaga accgaggtaa gtccgacaac8640
gttccctccg aagaggtcgt taagaagatg aagaactact ggcgacagct tctcaacgcc8700
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atcgagcaga tctccgagtt ctccaagcga gtcatcctcg ctgacgccaa ccttgataag9900
gttctctctg cttacaacaa gcaccgggac aagcccatcc gagagcaggc cgagaatatc9960
atccacctct tcactctcac caacctcggc gctcctgctg ccttcaagta cttcgacacc 10020
accattgacc gaaagaggta cacctccacc aaggaagtcc tcgacgccac cctgatccac 10080
cagtccatca ccggcctcta cgaaacccga atcgacctct cccagctcgg cggtgactct 10140
cgagccgacc ccaagaagaa gcgaaaagtc taaatatccg aagatcaaga gcgaagcaag 10200
ttgtaagtcc aggacatgtt tcccgcccac gcgagtgatt tataacacct ctcttttttg 10260
acacccgctc gccttgaaat tcatgtcaca taaattatag tcaacgacgt ttgaataact 10320
tgtcttgtag ttcgatgatg atcatatgat tacattaata gtaattactg tatttgatat 10380
atatactaat tacaatagta catattagaa catacaatag ttagtgccgt gaagtggctt 10440
aaaataccgc gagtcgatta cgtaatatta ttacctcttg cccatcgaac gtacaagtac 10500
tcctctgttc tctccttcct ttgctttgtg cacgaagaac tgcggtcagg tgacacaact 10560
ttttccatct cagggtgtgt cgcgtgtgct tcatccaaac tttagttggg gttcgggttc 10620
gcgcgagatg atcacgtgcc ctgatttggt gtcgtccccc gtcgcgctgc gcacgtgatt 10680
tatttatttc cggtggctgc tgtctacgcg gggccttctc tgcccttctg tttcaacctt 10740
cgggcggttc tcgtaaccag cagtagcaat ccatttcgaa actcaaagag ctaaaaacgt 10800
taaacctcag cagtcgctcg acgaatgggc tgcggttggg aagcccacga ggcctatagc 10860
cagagcctcg agttgacagg agcccagacg ccttttccaa cggcaacttt tatataaaat 10920
ggcaatgtat tcatgcaatt gcggccgtgt caggttggag acactggacc acactctcca 10980
ttgcttcctg aggagatgga tcattgctag tgcatctacg cgcagcaatc ccgcaagctc 11040
gacaaccgta gatgggcttt ggtgggccaa tcaattacgc aacccgcacg ttaaattgta 11100
tgaggaagga aggccacggt acaaagtggg tggtcttcac ccagtggttg ttggtggcgt 11160
catgcagacc atggccgcca gtgtgctgga attgaatatt taccgttcgt ataatgtatg 11220
ctatacgaag ttataccggt ctcgtagtgt tcacgttcag ttcacggtga gcttaaaact 11280
atcttcaaga agagatttga gacctgattt atacttgcag caatgtttac ttcttatcgc 11340
gatacacgaa tgtgatacgg atcaaagtaa gcaggactac gataagataa cgaatgcggt 11400
gcagtccatg tcgattaggt atagatacat ttattttgtg ttatgttaca ttttgggggg 11460
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cagagggtga accccatccg ccggta11606
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有用于DrBCO、 LmATF-S480Q_G409A_V407I_H69A_I484L和FfRDH的表达系统的质粒
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cagccaaagt ggatcatgat ggacggaaat atcggactgg aggccaaaaa ggaggtgctc 120
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cccaacactg cagagctcga ggccatgttc gaggcattcc acgagaaggg ccgatttgac 300
gttgacgact ggtttccagt catagacggt cttgctctcg gagctgactt tagaaacgga 360
gccaccatgt tgtcgcacca acatcgtgga ctcaaagcta ttctcgaaca aggaactctg 420
gcccaggcaa tccacatgct accatacatc ccaactttga tcatcaaggg cggagccaac 480
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tatacaatat ctatgtgaaa ttcgtcggca gctttcggct gatgaactac gagttcttcg1020
taataaatca tcaacgtaat aagcttggta ccagagacgg gttggcggcg tatttgtgtc1080
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gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 12180
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cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 12300
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 12360
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 12420
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 12480
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 12540
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 12600
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 12660
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 12720
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 12780
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 12840
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 12900
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 12960
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 13020
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 13080
gctgcaatga taccgcgaga gccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 13140
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 13200
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 13260
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 13320
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 13380
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 13440
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 13500
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 13560
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 13620
attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 13680
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 13740
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 13800
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 13860
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 13920
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 13980
acctataaaa ataggcgtat cacgag14006
<210>16
<211>8843
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于表达嵌合YlLIP2pre-CrLIP1蛋白的质粒
<400>16
aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat60
gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 120
tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 180
tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 240
ccaagcttgg taccagagac gggttggcgg cgtatttgtg tcccaaaaaa cagccccaat 300
tgccccaatt gaccccaaat tgacccagta gcgggcccaa ccccggcgag agcccccttc 360
accccacata tcaaacctcc cccggttccc acacttgccg ttaagggcgt agggtactgc 420
agtctggaat ctacgcttgt tcagactttg tactagtttc tttgtctggc catccgggta 480
acccatgccg gacgcaaaat agactactga aaattttttt gctttgtggt tgggacttta 540
gccaagggta taaaagacca ccgtccccga attacctttc ctcttctttt ctctctctcc 600
ttgtcaactc acacccgaaa tcgttaagca tttccttctg agtataagaa tcattcgcta 660
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tgctcccact gctactctcg ctaacggtga cactattact ggtctgaacg ctattattaa 780
cgaggctttc ctcggtattc ccttcgctga gccccccgtt ggtaaccttc gattcaagga 840
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cgttatgcag tctaaggttt tcgaggctgt ttctccctct tctgaggact gtctcactat1020
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tttcggtggt ggtttcgagg ttggtggtac ttctactttc ccccctgctc agatgattac1140
taagtctatt gctatgggta agcccattat tcacgtttct gttaactacc gagtttcttc1200
ttggggtttc ctggctggtg acgagattaa ggctgagggt tctgctaacg ctggtcttaa1260
ggaccagcga ctcggtatgc agtgggttgc tgacaacatt gctgctttcg gtggtgaccc1320
cactaaggtt actattttcg gtgagtctgc tggttctatg tctgttatgt gtcacattct1380
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atgctggccg agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc3780
attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct3840
aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga3900
gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc3960
ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga4020
taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga4080
tatgtaattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta4140
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agctaatacg attgaactac ttatacttat atgaggcttg aagaaagctg acttgtgtat4320
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agcatgcatc tagtggtgtg ttctgtggag cattctcact tttggtaaac gacattgctt4440
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gcgataactc aatccaatta ccccccacaa catgactggc caaactgatc tcaagacttt4560
attgaaatca gcaacaccga ttctcaatga aggcacatac ttcttctgca acattcactt4620
gacgcctaaa gttggtgaga aatggaccga caagacatat tctgctatcc acggactgtt4680
gcctgtgtcg gtggctacaa tacgtgagtc agaagggctg acggtggtgg ttcccaagga4740
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tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc6960
tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg7020
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taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg7320
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca7380
tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa7440
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt7500
gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc7560
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ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc8220
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gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc8340
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg8400
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata8460
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ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg8640
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt8700
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt8760
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga8820
gcgcagcgag tcagtgagcg agg8843
<210>17
<211>13802
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于表达Cas9的质粒；靶向 LIP2、LIP3和 LIP8的引导RNA
<400>17
ggttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
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ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc1140
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cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct1620
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cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa1740
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cccacgcaga taatgtattg aggggtggag cgcctcttgg ggacttgctg tacttgtacg2280
ggatattaaa cgcactcagc aagaccatga cgtaaaacac acctactgta cgatacgtac2340
tgtaggtatt gtactcgtac ccggtactac aaatagtacg atactatacg gagtgtattt2400
gtaccttgat atacgactgg cggagtgaag agaaggagtt gaacaagacc agatggggat2460
atcagcccca gtgctttgta ttacaagtac gagtacttaa tagatactgt aaggctattg2520
atacggatgg cagtaagtca ttgagtaagc aattgtggcc cagcatctcc cctacgtact2580
tgtaccatac cccatggaga caccaatggt ctttcacgca cactgtcgtg tgctgtatcg2640
cagaatcggg tgtccaacca aatgccgtta cccccacgtc acagccgata gacagataca2700
ccatcaatac cagcaggttg tatcatgcgg ttggctgaag gtaagctgat tggtctaaaa2760
actgtagctg tcctaattca acgagcgcta tttggggcca accacctcgg ccaagcggcc2820
tttaatctgc gtgccccaga ggcgtctaat gaggctctgg ccgccactgt aggagtgttt2880
ctctgtgcgc acacgcagtt ttgagtttgg gcgactttcc ctttttccca attgcgtaca2940
cacacagctc cgagctaagc gctgtccttg aaccttctcc ctcttttccc tctttttctc3000
ttccccttcc cctcctccac attaaggcca aatcctgaat tgcaccaact agtacaacga3060
caacaatgga caagaagtac tccatcggtt tggacattgg tactaactct gtcggctggg3120
ccgtcatcac cgacgagtac aaggttccct ccaagaagtt caaggtcctt ggcaacaccg3180
accgacactc tatcaagaag aacctgatcg gtgctctgct gttcgactct ggcgagactg3240
ccgaggccac ccgactgaag cgaaccgctc gacgccgata cacccgacga aagaaccgaa3300
tctgttacct ccaggagatc ttcagcaacg agatggctaa ggtcgacgac tccttcttcc3360
accgactcga ggagtctttc ctggtcgaag aggataagaa gcacgagcga caccccatct3420
tcggcaacat tgttgatgag gttgcctacc atgagaagta ccccaccatc taccacctcc3480
gaaagaagct cgtcgactcc actgacaagg ctgacctccg actcatctac cttgctctcg3540
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ga13802
<210>18
<211>13246
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于表达Cas9的质粒；靶向LIP4的引导RNA
<400>18
ggttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta60
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acgctggcta cattgacggt ggtgcttccc aggaagagtt ttacaagttc atcaagccta4200
ttctggagaa gatggacggt accgaggagc tgctcgtcaa gctcaaccga gaggacctcc4260
ttcgaaagca gcgaaccttc gataacggct ccatccccca ccagatccac ctgggtgagc4320
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>LIP4 CRISPR靶向序列
<400>23
ttacacccac tctatcggag20
<210>24
<211>551
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>24
Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala
1 5 1015
Ala Ala Pro Thr Ala Thr Leu Ala Asn Gly Asp Thr Ile Thr Gly Leu
202530
Asn Ala Ile Ile Asn Glu Ala Phe Leu Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro
354045
Pro Val Gly Asn Leu Arg Phe Lys Asp Pro Val Pro Tyr Ser Gly Ser
505560
Leu Asp Gly Gln Lys Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Ser Cys Met Gln Gln
65707580
Asn Pro Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Asn Leu Pro Lys Ala Ala Leu Asp
859095
Leu Val Met Gln Ser Lys Val Phe Glu Ala Val Ser Pro Ser Ser Glu
100 105 110
Asp Cys Leu Thr Ile Asn Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Lys Ala Gly
115 120 125
Ala Asn Leu Pro Val Met Leu Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val
130 135 140
Gly Gly Thr Ser Thr Phe Pro Pro Ala Gln Met Ile Thr Lys Ser Ile
145 150 155 160
Ala Met Gly Lys Pro Ile Ile His Val Ser Val Asn Tyr Arg Val Ser
165 170 175
Ser Trp Gly Phe Leu Ala Gly Asp Glu Ile Lys Ala Glu Gly Ser Ala
180 185 190
Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Arg Leu Gly Met Gln Trp Val Ala Asp
195 200 205
Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly Asp Pro Thr Lys Val Thr Ile Phe Gly
210 215 220
Glu Ser Ala Gly Ser Met Ser Val Met Cys His Ile Leu Trp Asn Asp
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Gly Asp Asn Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ile Met
245 250 255
Gln Ser Gly Ala Met Val Pro Ser Asp Ala Val Asp Gly Ile Tyr Gly
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275 280 285
Ser Asp Lys Leu Ala Cys Leu Arg Gly Val Ser Ser Asp Thr Leu Glu
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Asp Ala Thr Asn Asn Thr Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Ser Ser Leu Arg
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Leu Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Asp Gly Val Asn Ile Thr Asp Asp Met
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Thr Leu Ala Arg Arg Tyr Phe Leu Asn His Tyr Thr Gly Gly Thr Lys
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450 455 460
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Ser Leu Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Ile Ala Phe Ala Thr Asp Leu Asp
485 490 495
Pro Asn Thr Ala Gly Leu Leu Val Lys Trp Pro Glu Tyr Thr Ser Ser
500 505 510
Ser Gln Ser Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Asn Ala Leu Gly Leu Tyr
515 520 525
Thr Gly Lys Asp Asn Phe Arg Thr Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Phe Ser
530 535 540
Asn Pro Pro Ser Phe Phe Val
545 550