技术领域
本发明属于药物化学技术领域，更具体地说，涉及一种熊去氧胆酸的制备方法及中间体。
背景技术
熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid，UDCA)，分子式为C24H40O4。熊去氧胆酸是名贵中药熊胆所含的主要成分，是美国FDA批准的原发性胆汁性肝硬化(PBC)的一线治疗药物，在临床上还可以有效治疗胆结石类疾病和慢性肝病，具有广阔的市场前景。熊去氧胆酸结构式为
UDCA过去主要从天然熊胆中提取，但活熊资源十分有限，并且违反了动物保护法。随着UDCA的临床用量的增加，开发高效、经济的UDCA合成方法势在必行。近些年，UDCA主要以胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)或猪去氧胆酸(HDCA)作为原料制备熊去氧胆酸。但是CA、CDCA和HDCA都是从胆汁酸中提取的，属于动物性原料。动物源产品带来的风险对于制药工业始终存在，这主要是因为一些动物源产品可能携带病毒等感染因子，很难检测。而基于植物源的原料来合成UDCA，则可以规避这类风险。
目前，有多篇文献报道了用植物源的原料来合成UDCA。现有技术CN111072744A报道的方法如路线1所示，该方法以BA(bisnoralcohol，CAS号：40736-33-2)为原料(其由植物甾醇经生物发酵所得)，使用了重铬酸吡啶盐(PDC)，存在铬金属污染的问题，而且该路线的最后一步使用雷尼镍氢化还原，立体选择性差。
现有技术CN113461764A报道的方法如路线2所示，该方法的原料是将BA的7位羟化获得，但是目前，该技术还不成熟，不易放大生产，成本也高。另外，该路线的第5步中，硼氢化钠还原生成3位羟基的立体选择性往往不好，且硼氢化钠放大生产有危险性。
现有技术CN115181150A报道的方法如路线3所示，该方法以BA为原料，经过7步反应制备得到UDCA，其中步骤C中，利用格氏试剂的反应放大操作不容易，不适合工业放大生产，而且步骤G中，利用雷尼镍的氢化还原的立体选择性差。
现有技术CN115521964A公开了如路线4所示的熊去氧胆酸的制备方法，最后一步酶催化7-位羟化，但是该技术还不成熟，不容易放大生成，成本高。
现有技术CN115505622A公开了如路线5所示的熊去氧胆酸的制备方法，其中化合物I先经3α-类固醇脱氢酶还原为中间态I，再经过7β-类固醇脱氢酶还原为UDCA。
该制备方法所用原料化合物I是由化合物M得到的，而化合物M为BA经一系列合成得到，得到化合物I的过程中需要使用高污染的琼斯氧化，而且从化合物I得到化合物II需要繁琐的两步酶催化还原。
因此，如何得到一种工艺方法简单、条件温度、产物收率高且适用于工业化生产的去熊氧胆酸的制备方法。
发明内容
针对现有技术中熊去氧胆酸制备方法存在的问题，本发明的目的是提供一种熊去氧胆酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)化合物A与乙二醇进行缩合反应，生成化合物B，反应式如下：
(2)化合物B进行氧化反应，生成化合物C，反应式如下：
在另一优选例中，步骤(1)中，缩合反应是在酸存在下进行的。在另一优选例中，步骤(1)中，缩合反应是在酸和吸水剂存在下进行的。在另一优选例中，所述酸选自对甲苯磺酸、邻硝基苯磺酸、对氯苯磺酸或其组合。在另一优选例中，所述吸水剂选自原甲酸三乙酯、原甲酸三甲酯、原甲酸三丁酯，或其组合。
在另一优选例中，步骤(1)中，化合物A与乙二醇的重量体积比为0.1～5g/10ml，更0.5～2g/10ml。
在另一优选例中，步骤(1)中，化合物A与酸的摩尔比为1:0.05～0.5。
在另一优选例中，步骤(1)中，化合物A与吸水剂的摩尔比为1:2～10，更佳地，1:3～8。
在另一优选例中，步骤(1)中，反应所用溶剂选自四氢呋喃、丙酮、甲苯或其组合。
在另一优选例中，步骤(1)中，反应温度为30℃～70℃，更佳地，40℃～60℃。
在另一优选例中，步骤(1)中，反应时间为3～8h。
在另一优选例中，步骤(2)中，氧化反应是在氧源、催化剂和引发剂存在下进行的。在另一优选例中，所述催化剂选自N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基邻磺酰苯甲酰亚胺、N,N'二羟基均苯四酸亚胺或其组合。在另一优选例中，所述引发剂选自过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈或其组合。在另一优选例中，所述氧源选自氧气和/或空气。
在另一优选例中，步骤(2)中，化合物B与催化剂的摩尔比为1:0.01～2.0，更佳地1:0.3～0.7。
在另一优选例中，步骤(2)中，化合物B与引发剂的摩尔比为1:0.001～0.1，更佳地1:0.3～0.7。
在另一优选例中，步骤(2)中，反应所用溶剂选自二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯或其组合。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述氧源选自氧气，所述氧化反应是在氧气气氛中进行的。
在另一优选例中，步骤(2)中，反应温度为30℃～70℃，更佳地，40℃～60℃。
在另一优选例中，步骤(2)中，反应时间为12h～20h。
在另一优选例中，所述熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤：
(3)化合物C进行氧化反应，生成化合物D，反应式如下：
在另一优选例中，步骤(3)中，氧化反应所用氧化剂选自N-溴代丁二酰亚胺、N-氯代丁二酰亚胺或N-碘代丁二酰亚胺或其组合。
在另一优选例中，步骤(3)中，氧化反应体系中还存在催化剂和相转移剂。在另一优选例中，所述催化剂选自2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(4-OH-TEMPO)、4-甲氧基-四甲基哌啶氧化物(4-甲氧基-TEMPO)或其组合。在另一优选例中，所述相转移剂选自四丁基碘化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵或其组合。
在另一优选例中，化合物C与氧化试剂的摩尔比为1:1～3，更佳地1:1.0～1.5，最佳地1:1.3～1.5。在另一优选例中，化合物C与催化剂的摩尔比为1:0.001～0.1，更佳地1:0.005～0.05，最佳地1:0.01。在另一优选例中，在另一优选例中，相转移剂与溶剂的摩尔体积比为0.005～0.1mmol/ml，更佳地0.01～0.05mmol/ml。
在另一优选例中，步骤(3)中，反应所用溶剂选自甲苯、二甲苯、二氯甲烷、二氯乙烷、水或其组合。
在另一优选例中，所述熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤还包括以下步骤：
(4)化合物D与Wittig试剂反应，生成化合物E，反应式如下：
在另一优选例中，R1为甲基或乙基。
在另一优选例中，所述Wittig试剂选自甲氧甲酰亚甲基三苯基膦或乙氧甲酰亚甲基三苯基膦。
在另一优选例中，化合物D与Wittig试剂的摩尔比为1:1～2.5，更佳地，1:1～1.5。
在另一优选例中，步骤(4)中，反应所用溶剂选自甲苯、二甲苯或其组合。
在另一优选例中，步骤(4)中，反应温度为90℃～150℃，更佳地100℃～115℃。
在另一优选例中，步骤(4)中，反应时间为3～8h。
在另一优选例中，所述的熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤：
(5)化合物进行脱缩酮保护基，生成化合物F，反应式如下：
在另一优选例中，脱缩酮保护基是在酸性条件下进行的。在另一优选例中，所用酸选自盐酸、氢溴酸、乙酸、硫酸或其组合，更佳地盐酸。
在另一优选例中，步骤(5)中，反应所用溶剂选自丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷或其组合。
在另一优选例中，步骤(5)中，反应温度为0℃～40℃，更佳地20℃～30℃。
在另一优选例中，步骤(5)中，反应时间为3-8h。
在另一优选例中，所述的熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤：
(6)化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G，反应式如下：
在另一优选例中，步骤(6)中，氢化反应是在催化剂和氢源存在下进行的。在另一优选例中，所述氢源选自氢气和/或甲酸铵或其组合。在另一优选例中，所述催化剂选自钯碳、氢氧化钯、雷尼镍或其组合。
在另一优选例中，步骤(6)中，所述氢源选自氢气，氢气压力为0.1～2.0MPa。
在另一优选例中，步骤(6)中，所述催化剂选自Pd/C，化合物F与Pd/C的重量比为10～100:1。
在另一优选例中，步骤(6)中，反应所用溶剂选自甲醇、二氯甲烷、丙酮、吡啶或其组合。
在另一优选例中，步骤(6)中，反应温度为0℃～40℃，更佳地，15℃～30℃。
在另一优选例中，步骤(6)中，反应时间为10h～23h。
在另一优选例中，所述熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤：
(7)化合物G进行酯水解反应，生成化合物H，反应式如下：
在另一优选例中，步骤(7)中，酯水解反应是在碱存在下进行的，所述碱选自氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化锂或其组合，更佳地，氢氧化钠。
在另一优选例中，步骤(7)中，化合物G与碱的摩尔比为1:1～10，更佳地1:2～5。
在另一优选例中，步骤(7)中，反应所用溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、水或者其组合。
在另一优选例中，步骤(7)中，反应温度为40℃～70℃，更佳地，50℃～60℃。
在另一优选例中，步骤(7)中，反应时间为1h～4h。
在另一优选例中，所述熊去氧胆酸的制备方法还包括以下步骤：
(8)化合物H进行羰基还原，生成化合物I，反应式如下：
所述羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶同时存在下经一步反应进行的。
在另一更优选例中，化合物H的羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ IDNO.3的所示的葡萄糖脱氢酶以及葡糖糖存在下进行的，其中氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQID NO.3的所示的葡萄糖脱氢酶是由同一种工程菌提供的。在另一优选例中，所述3α-甾体脱氢酶、7β-甾体脱氢酶和葡萄糖脱氢酶为菌体形式，由同一种工程菌湿细胞提供。在另一优选例中，所述工程菌湿细胞通过4℃，6000rpm离心含有该工程菌的发酵液5min得到。在另一优选例中，化合物G与工程菌湿细胞的质量比为1:0.5～1.5，更佳地1:1。在另一优选例中，反应体系中还存在辅酶。在另一优选例中，辅酶选自NADH、NADPH、NAD、NADP或其盐。在另一优选例中，辅酶的终浓度为0.1mM～2mM。在另一优选例中，反应体系中还存在用于辅酶再生的共底物，所述共底物为葡萄糖，化合物G与葡萄糖的质量比为1:0.5～2，更佳地，底物与葡萄糖质量比为1:1.0～1.5。在另一优选例中，反应温度为15～40℃，时间为0.5～3h，更佳地，反应温度为30℃，时间为2h。在另一优选例中，反应体系的pH值为6.0～7.0，更佳地，反应体系的pH为6.2～6.5。
在另一优选例中，本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法包括以下步骤：
化合物E进行脱缩酮保护基反应，生成化合物F，反应式如下：
化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G，反应式如下：
较佳地，氢化还原反应是在氢源和催化剂存在下进行的，
较佳地，所述氢源选自氢气或甲酸铵；所述催化剂选自钯碳，氢氧化钯或雷尼镍，
化合物G进行酯水解反应，生成化合物H，反应式如下：
化合物H进行羰基还原，生成化合物I，反应式如下：
羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶同时存在下经一步反应进行的。
在另一优选例中，本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法包括以下步骤：
化合物D与Wittig试剂反应，生成化合物E，反应式如下：
化合物E进行脱缩酮保护基反应，生成化合物F，反应式如下：
化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G，反应式如下：
较佳地，氢化还原反应是在氢源和催化剂存在下进行的，
较佳地，所述氢源选自氢气或甲酸铵；所述催化剂选自钯碳，氢氧化钯或雷尼镍，
化合物G进行酯水解反应，生成化合物H，反应式如下：
化合物H进行羰基还原，生成化合物I，反应式如下：
羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶同时存在下经一步反应进行的。
在另一优选例中，本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法包括以下步骤：
化合物C进行氧化反应，生成化合物D，反应式如下：
化合物D与Wittig试剂反应，生成化合物E，反应式如下：
较佳地，所述Wittig试剂选自甲氧甲酰亚甲基三苯基膦或乙氧甲酰亚甲基三苯基膦，
化合物E进行脱缩酮保护基反应，生成化合物F，反应式如下：
化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G，反应式如下：
化合物G进行酯水解反应，生成化合物H，反应式如下：
化合物H进行羰基还原，生成化合物I，反应式如下：
羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶同时存在下经一步反应进行的。
在另一优选例中，本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法包括以下步骤：
化合物B进行氧化反应，生成化合物C，反应式如下：
化合物C进行氧化反应，生成化合物D，反应式如下：
化合物D与Wittig试剂反应，生成化合物E，反应式如下：
化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G，反应式如下：
较佳地，氢化还原反应是在氢源和催化剂存在下进行的，
较佳地，所述氢源选自氢气或甲酸铵；所述催化剂选自钯碳，氢氧化钯或雷尼镍，
化合物G进行酯水解反应，生成化合物H，反应式如下：
化合物H进行羰基还原，生成化合物I，反应式如下：
羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7β-甾体脱氢酶同时存在下经一步反应进行的。
本发明还提供了一种化合物，其结构式如下所示，
附图说明
图1是化合物B的核磁氢谱图；
图2是化合物C的核磁氢谱图；
图3是化合物D的核磁氢谱图；
图4是化合物E-1的核磁氢谱图；
图5是化合物H的核磁氢谱图；
图6是化合物I的核磁氢谱图；
图7是重组大肠杆菌诱导共表达3α-甾体脱氢酶(3α-HSDH)，7β-甾体脱氢酶(7β-HSDH)和葡萄糖脱氢酶(GDH)三个蛋白的SDS-PAGE图。
具体实施方式
本申请发明人针对现有技术中，熊去氧胆酸的制备方法中存在的缺陷，经过深入的研究，得到了本发明的技术方案。本发明的方法原料易得，反应条件温和，后处理无需柱层析纯化，操作简单适合工业化生产。
本发明的描述中，本发明的描述中“室温”指0℃～40℃，例如，15℃～35℃，15℃～30℃，20℃～30℃，22℃、25℃、28℃等。
本发明的描述中，“C1～C6烷基”指含1至6个碳的烷基。例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基等。
在本发明的一个具体实施例中，本发明的熊去氧胆酸的制备方法包括以下步骤：
(1)化合物A与乙二醇反应，生成化合物B：
(2)化合物B进行氧化反应，生成化合物C；
(3)化合物C进行氧化反应，生成化合物D；
(4)化合物D与Wittig试剂反应，生成化合物E；
(5)化合物E进行脱缩酮保护基反应，生成化合物F；
(6)化合物F进行氢化还原反应，生成化合物G；
(7)化合物G进行酯水解反应，生成化合物H；
(8)化合物H进行羰基还原，生成化合物I；
反应式如下：
其中R1为C1～C6烷基。
步骤(1)中，化合物A与乙二醇进行反应，生成化合物B。在本发明的一些具体实施例中，反应体系中还存在对甲苯磺酸和原甲酸三乙酯，反应完成后，冷却反应液，倒入冰水中析出固体，过滤，所得滤饼用少量冰水淋洗，然后用甲醇打浆，过滤，所得滤饼干燥得到目标化合物。
步骤(2)中，较佳地，化合物B在催化剂存和引发剂在下，利用氧气或者空气氧化生成化合物C。催化剂包括但不局限于N-羟基邻苯二甲酰亚胺、N-羟基邻磺酰苯甲酰亚胺、N,N'二羟基均苯四酸亚胺；引发剂包括但不局限于过氧化苯甲酰、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈。在本发明的一些具体实施例中，催化剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺，引发剂为过氧化苯甲酰组合，氧气为氧源。氧化完成后，降温过滤反应液以去除不溶物，滤液除去溶剂后得到的残留物使用二氯甲烷打浆，滤液使用饱和碳酸氢钠洗涤并使用无水硫酸钠干燥，旋干得到目标化合物。
步骤(3)中，氧化反应所用氧化剂包括但不局限于N-溴代丁二酰亚胺、N-氯代丁二酰亚胺、N-碘代丁二酰亚胺，或其组合。进一步地，氧化反应体系中还存在催化剂和相转移剂。所述催化剂包括但不局限于2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物、4-甲氧基-四甲基哌啶氧化物，所述相转移剂包括但不局限于四丁基碘化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵或其组合。在本发明的一些具体实施例中，化合物C在2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和四丁基溴化铵存在下被N-溴代丁二酰亚胺氧化，TLC检测反应完成后，加入饱和亚硫酸钠搅拌至反应液无氧化性，利用二氯甲烷萃取有机相，浓缩，干燥即得到目标化合物。
步骤(4)中，Wittig试剂包括但不局限于甲氧甲酰亚甲基三苯基膦和乙氧甲酰亚甲基三苯基膦，在本发明的一些具体实施例中，TLC检测无原料剩余，浓缩反应液，用甲醇打浆，过滤，干燥残留物，即得到目标化合物。
步骤(5)中，化合物E在酸性条件下脱缩酮保护基反应，按照本领域此类反应的常规方法进行。该步骤在酸性条件下进行，酸包括但不局限于盐酸、氢溴酸、乙酸、硫酸。在本发明的一些具体实施例中，酸是盐酸，反应完成后，调节体系pH至中性，分液，浓缩有机相，干燥所得残留物得到目标化合物。
步骤(6)中，化合物F在催化剂和氢源存在下，氢化还原生成化合物G。催化剂包括但不局限于钯碳、氢氧化钯和雷尼镍。氢源包括但不局限于氢气和甲酸铵。在本发明的一些具体实施例中，催化剂是Pd/C，氢源是氢气，反应完成后，过滤反应液，滤液浓缩后，残留物利用甲醇打浆，过滤，所得滤饼干燥得到目标化合物。
步骤(7)中，化合物G的酯基团进行水解，按照本领域此类反应的常规方法进行。化合物G在碱存在下水解生成化合物H。碱包括但不局限于氢氧化钠，氢氧化钾和氢氧化锂。在本发明的一些具体实施例中，水解所用碱是氢氧化钠，反应完成后，浓缩反应液，再加入水和二氯甲烷，得到的水相用盐酸调pH至2-3，析出固体，过滤，得到的滤饼经干燥得到目标化合物。
步骤(8)中，化合物H进行羰基还原，生成化合物I。在本发明的一些具体实施例中，羰基还原是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的3α-甾体脱氢酶和氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的7β-甾体脱氢酶、氨基酸序列如SEQ ID NO.3的所示的葡萄糖脱氢酶、辅酶、葡萄糖同时存在下经一步反应进行的，其中3α-甾体脱氢酶、7β-甾体脱氢酶和葡萄糖脱氢酶是同一种工程菌提供的。在本发明的一些具体实施例中，化合物在含有葡萄糖、NADP二钠盐、大肠杆菌湿菌体(提供3α-甾体脱氢酶、7β-甾体脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)的正辛醇和磷酸盐缓冲液(pH为6.3)的混合液中，进行羰基还原，反应过程中，维持体系pH为6.2-6.5反应完成后，用NaOH水溶剂调体系pH至13，然后用盐酸调体系的pH至约2，析出固体，用甲醇溶解产物，过滤，滤液浓缩至干，用石油醚打浆，过滤，得到的滤饼经干燥得到目标化合物。
与现有技术相比，本发明的熊去氧胆酸的制备方法的有益效果在于：
1.反应原料易得，每一个步骤的反应条件均较温和，无需特殊的试剂，后处理均无需柱层析或多次重结晶纯化操作，操作简单适合工业化生产；
2.结合化学合成和生物合成的方法，产品纯度高，可达99.91％。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，实施例中所用的原料或试剂均可通过市售获得或者按照常规方法制备。
实施例1化合物B的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物A(CAS:40736-33-2，70.0g，211.79mmol)，对甲苯磺酸(3.64g，21.14mmol)，原甲酸三乙酯(168.8g，1138.99mmol)，乙二醇(700ml)，四氢呋喃(350ml)，加热至50℃搅拌5h。随后将反应液缓慢冷却至室温，将反应液倒入冰水(2100ml)中搅拌10min，析出固体，将反应液过滤，滤饼用冰水(140ml)淋洗，固体使用甲醇(350ml)打浆，过滤，45℃真空干燥，得到白色固体73.22g，收率91.5％，HPLC纯度99.1％。该产物的核磁氢谱参见图1，MS：m/z＝375[M+1]+。
实施例2化合物C的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物B(27.22g，72.02mmol，纯度约99.1％)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(6.78g，41.56mmol)，过氧化苯甲酰(0.73g，3.03mmol)，丙酮(408ml)，乙酸乙酯(408ml)，氧气置换3次后，氧气气氛，50℃下搅拌16h。原料反应完全后降温至-10℃搅拌1h过滤，滤液旋干后使用二氯甲烷打浆，过滤并使用冰二氯甲烷(10ml)淋洗，滤液使用饱和碳酸氢钠洗涤两次，有机相干燥旋干后白色固体23.16g，收率80.1％，HPLC纯度96.7％。该产物的核磁氢谱参见图2，MS：m/z＝389[M+1]+。
1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ5.67(1H),3.94(4H),3.33-3.68(2H),2.67(1H),2.32(1H),2.22(1H),2.03(1H),1.82-1.96(3H),1.69-1.80(1H),1.57-1.64(3H),1.43-1.50(2H),1.31-1.34(2H),1.24-1.29(3H),1.19-1.21(3H),1.04-1.08(3H),0.68-0.72(3H)。
实施例3化合物D的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物D(1.6g，3.98mmol，HPLC纯度96.7％)，TEMPO(0.06g，0.41mmol)，二氯甲烷(16ml)，磁力搅拌降温至0℃，加入四丁基溴化铵(0.13g，0.41)的水(6.4ml)溶液，分3～5批N-氯代丁二酰亚胺(0.63g,4.74mmol)，全部加入完毕后升温至40℃反应3h，原料反应完全，加入饱和亚硫酸钠搅拌至无氧化性，加入二氯甲烷萃取两次，最后干燥有机相，旋干得到产品1.45g，收率91.2％，HPLC纯度96.7％。该产物的核磁氢谱参见图3。
1H NMR(400MHZ,CDCl3):δ9.27-9.61(1H),5.67(1H),3.89-4.05(4H),2.64-2.71(1H),2.45-2.54(1H),2.30-2.41(1H),2.21-2.28(1H),1.83-2.01(4H),1.70-1.79(1H),1.57-1.69(3H),1.42-1.54(3H),1.27-1.42(3H),1.22-1.27(1H),1.21(3H),1.11-1.15(3H),0.73(3H)。
实施例4-1化合物E-1的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物D(4.5g，11.29mmol，HPLC纯度约97.0％)，甲氧甲酰亚甲基三苯基膦(4.28g，12.83mmol)，甲苯(45ml)，磁力搅拌升温回流反应4h，TLC检测无原料剩余。浓缩有机相，加入甲醇(9ml)，0℃打浆24h，过滤得到白色固体，干燥后为4.69g，收率93.3％，HPLC纯度99.4％。MS：m/z＝443[M+1]+。
实施例4-2化合物E-2的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物D(4.5g，11.29mmol，HPLC纯度约97.0％)，乙氧甲酰亚甲基三苯基膦(4.47g，12.83mmol)，甲苯(45ml)，磁力搅拌升温回流反应4h，TLC检测无原料剩余。浓缩反应液，加入甲醇(9ml)，0℃打浆24h，过滤得到白色固体，干燥后为4.60g，收率91.6％，HPLC纯度99.5％。MS：m/z＝457[M+1]+。
实施例5-1化合物F-1的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物E-1(20.0g，44.92mmol，HPLC纯度约99.4％)，6M盐酸(100ml)，四氢呋喃(200ml)，室温搅拌反应5h，TLC检测无原料剩余，使用饱和碳酸氢钠调节pH至7.0-7.2，分液，有机相干燥旋干后得到固体为17.29g，收率95.7％，HPLC纯度99.0％。该产物的核磁氢谱参见图4，MS：m/z＝399[M+1]+。
实施例5-2化合物F-2的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物E-2(20.0g，43.58mmol，HPLC纯度约99.5％)，6M盐酸(100ml)，四氢呋喃(200ml)，室温搅拌反应5h，TLC检测无原料剩余，使用饱和碳酸氢钠调节pH至7.0-7.2，分液，有机相干燥旋干后得到固体为17.49g，收率96.4％，HPLC纯度99.1％。MS：m/z＝413[M+1]+。
实施例6-1化合物G-1的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物F-1(2.0g，4.97mmol，HPLC纯度约99.0％)，丙酮(20ml)，Pd/C(100mg)，氢气置换后氢气保护，室温条件下搅拌16h。过滤除去不溶物，浓缩滤液后，得到残留物，加入甲醇(2ml)中，打浆，过滤，滤饼干燥后得到产品1.84g，收率91.0％，纯度98.9％。MS：m/z＝402[M+1]+。
实施例6-2化合物G-2的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物F-2(2.0g，4.80mmol，HPLC纯度约99.1％)，丙酮(20ml)，Pd/C(100mg)，氢气置换后氢气保护，室温条件下搅拌16h。过滤除去不溶物，浓缩滤液后，得到残留物，加入甲醇(2ml)中，打浆，过滤，滤饼干燥后得到产品1.82g，收率90.1％，纯度99.0％。
实施例7-1化合物H的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物H-2(1.0g，2.46mmol，纯度约98.9％)、乙醇(30ml)，氮气置换三次后氮气保护，滴加氢氧化钠水溶液(0.24g氢氧化钠溶于5ml水)，然后加热至内温56℃，搅拌2h。随后，浓缩至无明显液体流出，得到的残留物加入水(30ml)和二氯甲烷(10ml)的混合液中，搅拌30min后静止分层，保留水相，水相用1M盐酸水溶液调pH至2-3，大量淡黄色固体析出，搅拌2h后过滤，得到淡黄色固体，干燥后为0.92g，收率91.5％，纯度95.0％。该产物的核磁氢谱参见图5，MS：m/z＝389[M+1]+。
实施例7-2化合物H的制备
在室温下，向反应瓶中加入化合物H-1(1.07g，2.54mmol，纯度约99.0％)、乙醇(30ml)，氮气置换三次后氮气保护，滴加氢氧化钠水溶液(0.24g氢氧化钠溶于5ml水)，然后加热至内温55℃，搅拌2h。随后，浓缩至无明显液体流出，得到的残留物加入水(30ml)和二氯甲烷(10ml)的混合液中，搅拌30min后静止分层，保留水相，水相用1M盐酸水溶液调pH至2-3，大量淡黄色固体析出，搅拌2h后过滤，得到淡黄色固体，干燥后为0.94g，收率90.2％，纯度94.6％。该产物的核磁氢谱参见图6，MS：m/z＝389[M+1]+。
1H NMR(400MHZ,CDCl3),δ2.88(dd,1H),2.50(t,1H),2.38-2.43(m,1H),2.18-2.30(m,7H),2.04-2.11(m,2H),1.82-1.98(m,4H),1.43-1.67(m,5H),1.33-1.39(m,1H),1.31(s,3H),1.12-1.29(m,3H),0.96-1.00(m,1H),0.98(d,3H),0.73(s,3H)。
实施例9化合物I的制备
在室温下，向250mL三颈圆底烧瓶中加入化合物I(15.00g，36.60mmol，纯度约94.8％)，辅酶底物一水葡萄糖(22.92g，115.65mmol)，加入正辛醇(45ml)，pH7.0 0.1M磷酸盐缓冲液(45ml)，NADP二钠盐(CAS号：24292-60-2)(气在反应体系中的终浓度为1mM)，于35℃，400-600rpm机械搅拌条件下混匀物料。待物料混匀后，加入大肠杆菌湿菌体悬浮液(500g/L，30ml)，继续搅拌，测得反应初始pH为6.3，监测反应过程pH，使用4％ NaOH调节反应pH 6.2-6.5。反应2h后，向上述反应瓶中加40％ NaOH调pH至13左右，彻底溶解产物后，加浓盐酸调体系的pH至约2，使产物彻底析出，抽滤得滤饼，水洗滤饼以进一步除去水溶性杂质。滤饼加入甲醇(300ml)中，搅拌使产物彻底溶解于甲醇中，抽滤，并使用甲醇洗涤滤饼，收集除去菌体及蛋白的甲醇溶液。将甲醇溶液旋蒸浓缩至干，得到的残留物加入150mL石油醚中，打浆，抽滤得到除去杂质及正辛醇的滤饼，用石油醚洗涤滤饼，烘干后称重，得白色固体13.90g，收率96.7％，纯度99.91％，旋光+59.2°(药典标准+59.0～62.0°)。MS：m/z＝393[M+1]+。1H NMR(400MHz,CD3OD),δ3.48-3.56(m,2H),2.30-2.38(m,1H),2.18-2.25(m,1H),2.03(dt,1H),1.83-1.91(m,5H),0.99-1.66(m,24H),0.75(s,3H)。
上述大肠杆菌湿菌体悬浮液的制备过程如下：
(1)构建重组大肠杆菌
将SEQ ID NO.1所示的来源于Comamonastestosteroni的3α-甾体脱氢酶(简称3α-HSDH，NCBI登录编号：WP_003078312.1)，SEQ ID NO.2所示的来源于Clostridiumnigeriense的7β-甾体脱氢酶(简称7β-HSDH，NCBI登录编号：WP_066892209.1)，SEQ IDNO.3所示的来源于Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶(简称GDH，NCBI登录编号：WEZ47479.1)氨基酸序列，经由生工生物工程(上海)有限公司密码子优化后全合成并克隆到pET28a质粒的EcoRI/HindIII酶切位点之间(其中3α-HSDH密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，7β-HSDH密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GDH密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，构建pET28a-3αHSDH-7βHSDH-GDH三酶共表达重组质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到具有卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌(工程菌)E.coliBL21(DE3)-pET28a-3αHSDH-7βHSDH-GDH，后续命名该重组大肠杆菌为AU060021。经过SDS-PAGE蛋白表达验证(见图5)，结果表明三酶均成功表达，对应3α-HSDH蛋白分子量大小为23.2kDa，7β-HSDH的蛋白分子量为25.7kDa，GDH的蛋白分子量为24.8kDa。
(2)培养AU060021重组大肠杆菌
将AU060021重组大肠杆菌接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，100-250rpm培养至对数生长中期，获得种子液，所述LB培养基的组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 6.8-7.2。将种子液以体积1％-5％的接种量接种到含有卡那霉素50mg/L的TB培养基中，在37℃培养3-6h，直至菌体OD600nm～0.6-0.8，加入终浓度为0.5-1mM的IPTG，于25℃，100-250rpm培养12-16h。所述的TB培养基组成为：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物40g/L，K2HPO4 12.5g/L，KH2PO4 2.3g/L，0.4％甘油，溶剂为去离子水。
(3)获得菌体悬浮液
将上述TB培养基培养所得AU060021重组大肠杆菌菌液于4℃，6000rpm离心5min，倒去上清，加入与湿菌体等质量pH 7.5的100mM磷酸缓冲液，震荡重悬得到菌体悬浮液备用。
本发明涉及的序列
SEQ ID NO.1(3α-甾体脱氢酶氨基酸序列)
来源：Comamonastestosteroni
NCBI编号：WP_003078312.1
IRDAEVIADLSTAEGRKQAIADVLAKCSKGMDGLVLCAGLGPQTKVLGNVVSVNYFGATELMDAFLPALKKGHQPAAVVISSVASAHLAFDKNPLALALEAGEEAKARAIVEHAGEQGGNLAYAGSKNALTVAVRKRAAAWGEAGVRLNTIAPGATETPLLQAGLQDPRYGESIAKFVPPMGRRAEPSEMASVIAFLMSPAASYVHGAQIVIDGGIDAVMRPTQF
SEQ ID NO.2(7β-甾体脱氢酶氨基酸序列)
来源：Clostridium nigeriense
NCBI编号：WP_066892209.1
MNVVMVGRREEMLKALGEDISSKYGVKHLVIKADFSDPNSTDEIFEKTKDLDMGFMSYVACFHTFGKLQDTPWEKHEQMLNVNVITFLKCFYHYMKIFSKQDRGAIINVSSLTGISASPYNAQYGAGKSYILKLTEAVAYEASKTNVDVEVITLGTTITPSLLKNLPGGPAGEAVMKAALTPEACVEEAFENLGKKFSIIAGEHNKASIHDWKANHTEDEFISYMGSFYER
SEQ ID NO.3(葡萄糖脱氢酶氨基酸序列)
来源：Bacillus subtilis
NCBI编号：WEZ47479.1
KVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG
SEQ ID NO.4(3α-甾体脱氢酶核苷酸序列)
ATCGGTGCGGCGACCCGTAAAGTTCTGGAAGCGGCGGGTCACCAGATCGTTGGTATCGATATCCGTGATGCGGAAGTTATCGCGGATCTGAGCACCGCGGAAGGTCGTAAACAGGCGATCGCGGATGTTCTGGCGAAATGCAGTAAAGGCATGGATGGCCTGGTTCTGTGCGCTGGTTTGGGCCCGCAGACCAAAGTTCTGGGCAACGTTGTTAGCGTTAACTACTTCGGCGCGACCGAACTGATGGATGCGTTCCTGCCGGCGCTGAAAAAAGGCCACCAGCCGGCGGCGGTTGTTATCAGCTCCGTTGCGAGCGCGCACCTGGCGTTCGATAAAAACCCGCTCGCGCTGGCGCTGGAAGCGGGCGAAGAAGCGAAAGCGCGTGCGATCGTGGAACACGCAGGTGAACAGGGTGGTAACCTGGCGTACGCGGGTTCTAAAAACGCGCTGACCGTTGCGGTTCGTAAACGTGCGGCGGCATGGGGTGAAGCGGGTGTTCGTCTGAACACCATCGCCCCGGGTGCGACCGAAACCCCGCTGCTGCAGGCGGGTCTGCAGGATCCGCGTTACGGTGAAAGCATCGCAAAATTTGTGCCGCCGATGGGTCGTCGTGCGGAACCGAGCGAAATGGCGAGCGTCATCGCATTCCTGATGTCCCCGGCGGCGAGCTACGTCCACGGCGCGCAGATCGTTATCGATGGTGGCATTGATGCAGTGATGCGTCCGACCCAGTTCTAAAAGCTT
SEQ ID NO.5(7β-甾体脱氢酶核苷酸序列)
ATGGGGCATCATCCTGGGCGCGACCGAAGGCGTTGGTAAAGCGTTCTGCGAAAAAATCGCGAGCGAAGGCATGAACGTTGTTATGGTTGGTCGTCGTGAAGAAATGCTGAAAGCGCTGGGTGAAGATATCAGCTCTAAATACGGCGTTAAACACCTGGTTATCAAAGCGGATTTCAGCGATCCGAACAGCACCGATGAAATCTTCGAAAAAACCAAAGATCTGGATATGGGCTTCATGTCTTATGTTGCGTGCTTCCACACCTTCGGTAAACTGCAGGATACCCCGTGGGAAAAACACGAACAGATGCTGAACGTGAACGTTATCACCTTCCTGAAATGCTTCTACCACTACATGAAAATCTTCTCCAAACAGGATCGTGGCGCGATCATCAACGTTTCTAGCCTGACCGGAATCTCCGCGAGCCCGTACAACGCGCAGTACGGTGCTGGCAAAAGCTACATCCTGAAACTGACCGAAGCGGTTGCGTACGAAGCGAGCAAAACCAACGTTGATGTTGAAGTTATCACCCTGGGTACCACCATCACCCCGAGCCTGCTGAAAAACCTGCCGGGCGGTCCGGCGGGTGAAGCGGTTATGAAAGCGGCGCTGACCCCGGAAGCGTGCGTTGAAGAAGCGTTCGAAAACCTGGGCAAGAAGTTCTCTATCATCGCAGGTGAGCATAATAAAGCTAGCATTCATGACTGGAAAGCTAACCACACCGAAGATGAGTTCATTAGCTACATGGGTAGCTTCTATGAACGCTAAAAGCTT
SEQ ID NO.6(葡萄糖脱氢酶核苷酸序列)
ACCGAACAGAAAGCGATCGTTACTGATGCACCGAAAGGCGGCGTTAAATACACCACCATTGACATGCCGGAACCGGAACACTACGATGCTAAACTGAGCCCGGTTTACATTGGCATTTGCGGCACCGATCGTGGTGAAGTGGCGGGTGCGCTGAGCTTCACCTATAACCCGGAAGGCGAAAACTTCCTGGTTCTGGGCCATGAAGCACTGCTGCGTGTGGATGAT
GCTCGTGATAACGGCTATATTAAAAAAGGTGATCTGGTGGTGCCGCTGGTACGTCGTC
CGGGTAAATGTATCAACTGCCGCATCGGTCGTCAGGATAACTGTTCTATCGGTGACCC
AGATAAACACGAAGCTGGTATCACCGGCCTGCACGGCTTCATGCGTGACGTTATCTAT
GATGATATCGAATATCTGGTTAAAGTGGAAGATCCGGAACTGGGTCGTATCGCGGTTC
TGACCGAACCGCTGAAAAACGTTATGAAAGCATTCGAAGTTTTTGATGTTGTTTCCAA
ACGCAGCATCTTCTTCGGCGATGATAGCACCCTGATCGGTAAACGTATGGTGATCATT
GGTAGCGGTTCTGAAGCGTTCCTGTACTCTTTCGCGGGTGTTGATCGCGGTTTCGATG
TTACCATGGTTAACCGTCACGATGAAACCGAAAACAAACTGAAAATTATGGATGAATT
TGGCGTTAAATTCGCTAACTATCTGAAAGATATGCCGGAAAAAATTGATCTGCTGGTT
GACACCTCTGGCGATCCGACCACCACCTTCAAATTCCTGCGTAAAGTGAACAACAAC
GGTGTGGTGATTCTGTTCGGTACTAACGGTAAAGCGCCGGGCTATCCGGTTGATGGCG
AAGATATTGATTACATTGTTGAACGTAACATTACCATCGCAGGTTCCGTAGATGCAGCG
AAAATCCACTACGTTCAGGCTCTGCAGTCTCTGAGCAACTGGAACCGTCGTCACCCG
GATGCGATGAAATCTATCATCACCTACGAAGCTAAACCGTCTGAAACCAACATCTTCT
TCCAGAAACCGCACGGTGAAATCAAAACCGTTATTAAATGGCAGTAA。