技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种荧光多肽探针及其制备方法。
背景技术
荧光法因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽和检测条件更接近生命体生理环境的优点，被广泛用于分析检测。荧光多肽即由荧光基团标记的一段多肽序列，可应用于生物大分子的检测。设计并合成特定序列的荧光多肽对于实现生物检测具有重要意义。然而，现有的特定序列的荧光多肽的合成方法往往存在原料昂贵，合成过程过于繁琐，合成效率不高等问题，大大影响了荧光多肽在生物检测中实际应用的进程。
本发明基于能够分别与炭疽芽孢和枯草杆菌芽孢结合的特定多肽序列，进行了荧光多肽的合成，以乙酰乙酸乙酯、间苯二酚和Fmoc-Lys-OH为起始原料，制备得到荧光标记的氨基酸，然后通过单体法采用Fmoc策略固相合成将荧光氨基酸引入到能够对杆菌特异性结合的多肽链的C端或N端，整个过程合成原料易得、操作简便，为荧光多肽在炭疽芽孢和枯草杆菌芽孢实际检测中的应用奠定了基础。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种荧光多肽探针。
一种荧光多肽探针，其结构包括：特异性靶向多肽，三个甘氨酸组成的手臂(GGG)，以及荧光标记的氨基酸(K*)，所述特异性靶向多肽的N端或C端与手臂(GGG)连接，手臂的另一侧连接荧光标记的氨基酸(K*)。
特异性靶向多肽是功能区，为了保证荧光基团不影响多肽序列的特异性结合功能，本发明选择在多肽序列与荧光标记氨基酸间加入一段手臂。手臂的选择以不会影响多肽功能区为准，因此，本发明采用三个甘氨酸组成的手臂。
进一步的，所述特异性靶向多肽的氨基酸序列为ATYPLPIR或者NHFLPKV。
进一步的，所述荧光标记的氨基酸为香豆素标记的赖氨酸。香豆素类荧光化合物具有荧光量子产率高、Stokes位移大、光稳定性好等诸多优点。
本发明的第二个目的是提供上述荧光多肽探针的制备方法。
一种荧光多肽探针的制备方法，包括以下步骤：
(一)荧光标记氨基酸的合成
以乙酰乙酸乙酯和溴乙酸乙酯为原料，以四氢呋喃为溶剂在氢化钠的作用下反应，生成产物与间苯二酚在冰水浴中反应生成4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯，再水解成为4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸，经转化为活化酯后与赖氨酸反应得到荧光标记的氨基酸(K*)；
(二)荧光多肽探针的合成
采用Fmoc策略和单体法，在Rink Amide树脂上依次进行树脂的活化、氨基酸的耦合、多肽从树脂上切除的步骤，最终得到荧光多肽探针。
本发明的合成路线如图1和图2所示。
进一步的，所述荧光标记氨基酸的合成步骤具体如下：
(1)在烧瓶中先后加入氢化钠、无水四氢呋喃，然后在其中缓慢滴入乙酰乙酸乙酯的四氢呋喃溶液，回流反应；再缓慢滴入溴乙酸乙酯的四氢呋喃溶液，回流反应，得到乙酰基琥珀酸二乙酯(2-乙酰基丁二酸二乙酯)产物；
(2)在冰水浴条件下将间苯二酚溶于浓硫酸中，然后滴加乙酰基琥珀酸二乙酯，反应完成后得到4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯；
(3)将氢氧化钠在冰水浴条件下溶于无水甲醇，然后加入4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯，反应完成后得到4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸；
(4)将4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸溶于无水DMF溶剂中，然后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、DCC和N,N-二甲胺基吡啶，室温搅拌反应，得到4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯；
(5)将4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯溶于无水DMF溶剂中，加入Fmoc-Lys-OH·HCl和DIEA，室温搅拌反应，得到荧光标记赖氨酸。
进一步的，所述荧光多肽探针的合成步骤具体如下：
(1)树脂的活化：取Rink Amide树脂置于固相反应器中，加入无水二氯甲烷浸泡溶胀，减压抽去二氯甲烷，以DMF洗涤树脂；
(2)脱Fmoc：在固相反应器中加入哌啶的DMF溶液，室温振荡反应，减压抽去哌啶的DMF溶液，再加入4mL 20％(v/v)哌啶的DMF溶液，室温振荡反应，反应结束后减压抽去哌啶的DMF溶液，分别以DCM和DMF洗涤树脂；
(3)氨基酸的耦合：根据预先设计的多肽序列进行氨基酸的耦合，适时加入荧光标记的赖氨酸耦合至多肽中。称取多肽C端第一个Fmoc保护的氨基酸、HOBt和HBTU溶于DMF中，加入DIEA，混合均匀后，加入固相反应器中与树脂混合，室温摇荡反应，减压抽去溶液，分别以DCM和DMF洗涤树脂；脱Fmoc保护并洗涤后，重复前述步骤，进行后续氨基酸的耦合直至多肽合成完毕；
(4)多肽从树脂上切除：向固相反应器缓慢加入三氟乙酸、纯水、苯甲硫醚、EDT和苯酚组成的混合溶液，反应后过滤，收集滤液，用氮气吹去大部分溶剂后，向残液中加入无水乙醚，出现白色絮状沉淀，离心收集沉淀、干燥得到白色絮状固体，即多肽。
本发明的有益效果为：
本发明基于能够分别与炭疽芽孢或枯草杆菌芽孢结合的特定多肽序列ATYPLPIR和NHFLPKV，进行了荧光多肽的合成。首先以乙酰乙酸乙酯、间苯二酚和Fmoc-Lys-OH为起始原料，通过亲核取代、Pechmann成环反应、酯水解、酯化成活化酯和Fmoc-Lys-OH侧链酰胺化五步反应合成了作为单体的香豆素标记荧光赖氨酸。接着，将荧光氨基酸分别引入到多肽链的C端和N端，并以单体法采用Fmoc策略固相合成了荧光多肽。本发明的合成方法具有原料易得，操作简单的优点。本发明得到的荧光多肽探针具有检测炭疽芽孢或枯草芽孢杆菌的作用。
附图说明
图1为荧光标记氨基酸K*的合成路线图。
图2为Fmoc策略固相合成多肽示意图。
图3为乙酰基琥珀酸二乙酯的ESI-MS图。
图4为4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯的ESI-MS图。
图5为4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸的ESI-MS图。
图6为4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯的ESI-MS图。
图7为荧光标记氨基酸(K*)的ESI-MS图。
图8为多肽P1的结构示意图。
图9为多肽P2的结构示意图。
图10为多肽P3的结构示意图。
图11为多肽P4的结构示意图。
图12为多肽P1的ESI-MS图。
图13为多肽P2的ESI-MS图。
图14为多肽P3的ESI-MS图。
图15为多肽P4的ESI-MS图。
图16为多肽P1的最大发射波长和最佳激发波长。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：荧光多肽探针的合成
一、荧光标记氨基酸的合成
(1)乙酰基琥珀酸二乙酯(2-乙酰基丁二酸二乙酯)的合成反应式如下：
在250mL三口烧瓶中，加入4.39g(0.11mol)60％(m/m)氢化钠，用少量石油醚洗涤2次，再加入50mL无水四氢呋喃(THF)。称取14.40g(0.11mol)乙酰乙酸乙酯，溶于50mL四氢呋喃，置于恒压滴液漏斗中。在搅拌下缓慢将乙酰乙酸乙酯溶液滴加至三口烧瓶中，稍稍加热，氢化钠固体逐渐溶解，溶液呈淡黄色。滴加完毕后使其轻微回流0.5h。称取16.80g(0.10mol)溴乙酸乙酯，溶于50mL四氢呋喃中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加至上述反应液中，溶液变浑浊，有白色固体生成，滴加完毕后继续回流2h。冷却，抽滤，滤液旋蒸除去溶剂后，转移至分液漏斗，加入约60mL乙酸乙酯，再加入60mL水，混合萃取，取乙酸乙酯层，水层再用60mL乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，再用饱和食盐水60mL洗涤2次后，用无水MgSO4干燥。除去溶剂，减压蒸馏所得产品，收集(加热电压140V，108℃)馏出产物，为无色油状液体，15.12g，产率约70％。ESI-MS(正离子模式)：m/z 239.9[M+Na]+(理论分子质量:216.1)，如图3所示。
(2)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯的合成
反应式如下：
在100mL圆底烧瓶中，加入2.51g(0.023mol)间苯二酚，在冰水浴冷却下，边搅拌边加入20mL浓硫酸。待间苯二酚完全溶解后，向溶液中滴加5.01g(0.023mol)用上述方法制得的乙酰基琥珀酸二乙酯。4h后逐渐有白色固体生成。TLC监测反应进程，反应充分后，将反应液与沉淀一并缓慢滴入搅拌的冰水中，待冰完全融化后，抽滤，用清水洗涤2～3次，晾干，得到淡黄色粉末，2.93g，产率约49％，Rf＝0.52(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，m.p.163.5±0.5℃，ESI-MS(负离子模式)：m/z 260.9[M-H]-(理论分子质量:262.1)，如图4所示。
(3)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸的合成(4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯的水解)
反应式如下：
在100mL圆底烧瓶中，加入4.48g(0.08mol)氢氧化钾，在冰水浴冷却下，加入30mL无水甲醇，搅拌使氢氧化钾完全溶解。向溶液中加入5.24g(0.02mol)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸乙酯。TLC监测反应进程，反应完成后，将反应液与150mL冰水混合，边搅拌边缓慢滴加浓盐酸，至pH约为4，体系中逐渐析出淡黄色固体，继续搅拌30min，抽滤，收集固体，用清水洗涤3次，真空干燥箱干燥过夜，得到淡黄色粉末，3.04g，产率约65％，Rf＝0.56(CH3OH:H2O＝4:1)，m.p.270±0.5℃,ESI-MS(负离子模式)：m/z 232.8[M-H]-(理论分子质量:234.0)，如图5所示。
(4)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯的合成
反应式如下：
在100mL圆底烧瓶中，加入60mL无水DMF，再加入2.34g(0.01mol)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸，完全溶解后，依次加入2.30g(0.02mol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、4.12g(0.02mol)DCC和0.24g(0.002mol)N,N-二甲胺基吡啶(DMAP)，室温搅拌反应，TLC监测反应进程，反应过程中逐渐有不溶固体生成。反应完成后，过滤，滤液减压除去DMF，残余物用快速制备色谱分离，得白色粉末状固体，2.48g，产率约75％，Rf＝0.50(乙酸乙酯:石油醚＝4:1)，m.p.187±0.5℃(分解)，ESI-MS(负离子模式)：m/z 329.8[M-H]-(理论分子质量:331.1)，如图6所示。
(5)荧光标记氨基酸(K*)的合成
反应式如下：
在100mL圆底烧瓶中，加入30mL无水DMF，再加入2.65g(0.008mol)4-甲基-7-羟基香豆素-3-乙酸琥珀酰亚胺酯，完全溶解后，加入2.94g(0.007mol)Fmoc-Lys-OH·HCl和2.58g(0.02mol)DIEA，室温搅拌反应，TLC监测反应进程。反应完成后，减压除去DMF，残余物用快速制备色谱分离，得白色粉末状固体，3.06g，产率约72％，Rf＝0.50(甲醇:二氯甲烷＝4:1)，ESI-MS(正离子模式)：m/z 584.8[M+H]+,606.8[M+Na]+(理论分子质量:584.2)，如图7所示。
二、荧光多肽的合成
分别在两种功能多肽的N端和C端引入荧光标记氨基酸。其中在功能多肽N端加入GGG手臂并引入荧光标记氨基酸K*，其序列分别为：K*GGG ATYPLPIR(记为P1，结构如图8所示)、K*GGG NHFLPKV(记为P2，结构如图9所示)；在功能多肽的C端加入GGG手臂并引入荧光标记氨基酸K*，其序列分别为(ATYPLPIR GGG K*)(记为P3，结构如图10所示)、(NHFLPKVGGG K*)(记为P4，结构如图11所示)。所有多肽的合成均从C端开始至N端结束。
(1)树脂的活化
多肽合成在Rink Amide树脂上进行。取200mg(0.1mmol)Rink Amide树脂(官能团负载量0.5mmol/g)置于固相反应器中，加入5.0mL无水二氯甲烷浸泡溶胀30分钟，减压抽去二氯甲烷，以DMF 4mL×3洗涤树脂。
(2)脱Fmoc
在固相反应器中加入4mL 20％(v/v)哌啶的DMF溶液，室温振荡反应20分钟，减压抽去哌啶的DMF溶液，再加入4mL 20％(v/v)哌啶的DMF溶液，室温振荡反应5分钟。反应结束后减压抽去哌啶的DMF溶液，分别以DCM 4mL×3，DMF 4mL×3洗涤树脂。
(3)氨基酸的耦合
根据预先设计的4条荧光多肽(P1-P4)的氨基酸序列进行耦合。首先连接第一个氨基酸，称取0.40mmol的多肽序列C端第一个Fmoc保护的氨基酸(P1为精氨酸R，P2为缬氨酸V，P3、P4为荧光标记赖氨酸)、0.40mmol的HOBt和0.40mmol的HBTU溶于4mL DMF中，加入0.80mmol DIEA，混合均匀后，加入固相反应器中与树脂混合，室温摇荡2小时，减压抽去溶液，分别以DCM 4mL×3，DMF 4mL×3洗涤树脂。脱去Fmoc保护并洗涤树脂，然后按照表1中步骤，根据4条多肽序列(P1-P4)开始接肽反应，每一轮都按表1中程序进行，直至最后一个氨基酸耦合完成(P1、P2为荧光标记赖氨酸，P3为丙氨酸A，P4为天冬酰胺N)。最终4条荧光多肽分别合成完毕。
表1氨基酸耦合操作
注：表1中活化的Fmoc-AA-OH由0.40mmol的Fmoc保护氨基酸、0.40mmol的HOBt和0.40mmol的HBTU和0.80mmol DIEA溶于4mL DMF中制成。
(4)多肽从树脂上切除
按照多肽的氨基酸序列全部完成连接后，向固相反应器缓慢加入由4.0mL三氟乙酸、100μL纯水、200μL苯甲硫醚、100μL EDT和200mg苯酚组成的混合溶液，反应3小时。过滤，收集滤液，用氮气吹去大部分溶剂后，向残液中加入20.0mL无水乙醚，出现白色絮状沉淀，在6000RPM转速下离心5分钟，除去溶剂乙醚，再次向沉淀中加入20.0mL无水乙醚，将固体充分分散后，同样条件下离心5分钟，再重复一次，除去大部分杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用去离子水溶解，冷冻干燥得到白色絮状固体，冷冻保存。
(5)多肽的质谱表征
通过质谱对荧光多肽产物进行表征。
P1：ESI-MS(正离子模式)：m/z 1444.3[M+H]+,722.9[M+2H]2+/2(理论分子质量:1443.8)，质谱表征结果见图12。
P2：ESI-MS(正离子模式)：m/z 1368.3[M+H]+,684.8[M+2H]2+/2(理论分子质量:1367.7)，如图13所示。
P3：ESI-MS(正离子模式)：m/z 1444.5[M+H]+,723.0[M+2H]2+/2(理论分子质量:1443.8)，如图14所示。
P4：ESI-MS(正离子模式)：m/z 1368.9[M+H]+,685.1[M+2H]2+/2(理论分子质量:1367.7)，如图15所示。
实施例2荧光多肽探针的性质
一、最佳激发波长和最大发射波长的确定
配制浓度为5mg/L的多肽样品(P1、P2、P3、P4)，以330nm为激发波长，在400nm～600nm区间扫描记录荧光发射情况，获得最大发射波长，再以最大发射波长为发射波长，在300nm～400nm区间扫描记录荧光激发情况，获得最佳激发波长。结果表明，四种荧光多肽探针的最大发射波长均为457nm，其对应的最佳激发波长为325nm。以P1为例，如图16所示。结果表明，在多肽功能区的N端或C端通过一段手臂的方式引入荧光标记基团，能够实现特定序列多肽的荧光标记。
二、溶剂对荧光性质的影响
分别用水，乙醇，二甲亚砜和乙腈等溶剂对多肽P4溶解，发现其在各溶剂中的溶解性都很好，但从荧光光谱数据分析，荧光多肽在不同溶剂中表现为不同的荧光性质，溶剂对最大发射波长的影响明显，对荧光发射强度有较大的影响，对最佳激发波长有一定影响。如表2所示，P4在不同溶剂中的荧光性质不同。
表2荧光多肽P4在不同溶剂中的荧光性质
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。