技术领域
本发明涉及多肽制备领域，具体涉及一种Fmoc-His-Aib-OH,R1的制备方法。
背景技术
对多肽或者蛋白质进行侧链修饰可以提高多肽或者蛋白质在生物体内稳定性。例如天然胰高血糖素样肽(GLP-1)容易被二基肽酶快速水解，通过修饰GLP-1侧链有效避免了被酶水解而失活。索马鲁肽(Semaglutide)是由丹麦诺和诺德开发的一种新型长效胰高血糖素样肽-1类似物。现有技术对索马鲁肽提纯大多采用色谱制备、固液制备等方法，分离纯化难度大、过程繁琐。这就需要在对多肽修饰过程中保证引入的修饰片段具有足够的纯度，以减少后续分离纯化压力。
Fmoc-His-Aib-OH作为索马鲁肽重要修饰片段，专利CN108059666B提到将Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC作用下生成活性酯Fmoc-His(Trt)-OSu，进一步和H-Aib-OH在碱的催化下生成Fmoc-His(Trt)-Aib-OH，其过程如下：
该方法还需要Fmoc-His(Trt)-Aib-OH再经一步脱Trt过程才能得到Fmoc-His-Aib-OH。重复该方法发现活性酯不稳定，在THF-水中非常容易水解形成Fmoc-His(Trt)-OH，后处理繁琐且收率低。
专利WO2013098191A1报道Fmoc-His(Trt)-Aib-OH在TIPS和TFA作用下脱去Trt得到Fomc-His-Aib-OH,TFA，但没有报道纯度。
Fomc-His-Aib-OH在索马鲁肽步骤中处在最后一步，故Fomc-His-Aib-OH中的单杂对API质量影响较大，CN112625087A中有公开了一种Fmoc-His(Trt)-Aib-OH的制备方法，总纯度最高只能达到98.27％，单杂含量较高。
发明内容
本发明目的在于提供一种Fmoc-His-Aib-OH,R1的制备方法，其反应流程如下：
其中R1选自TFA、HF、HCl、HBr或HOAc中任一种。
其反应步骤具体包括：
a)Fmoc-His(Trt)-OH在缩合剂的作用下与H-Aib-OtBu在有机溶剂中发生缩合反应形成Fmoc-His(Trt)-Aib-OtBu；
b)向步骤a)得到的含有Fmoc-His(Trt)-Aib-OtBu反应液中加入R1和TIPS，反应结束后，经过浓缩、水洗、分液、析晶处理得到高纯度的Fmoc-His-Aib-OH,R1。
作为优选，其中步骤(a)缩合剂选自HOBt、HBTU、EDC、DCC、DIEA中的一种或者它们中的两种或多种的组合。
作为优选，其中步骤(a)采用的有机溶剂选自THF、DCM、二氧六环中的一种或者它们中的两种或多种的组合。
作为优选，其中步骤(a)的反应温度为-20-20℃。
作为优选，其中步骤(b)的反应温度为0-30℃。
作为优选，其中步骤(b)中Fmoc-His(Trt)-Aib-OtBu：TFA：TIPS摩尔当量比为1:(20～30):(1～3)。
作为优选，其中步骤(b)中析晶溶剂为DCM、乙腈、正庚烷、MTBE中的一种或者它们中的两种或多种的组合。
与现有技术相比，本发明制备由Fmoc-His(Trt)-OH经缩合脱保护两个阶段直接得到Fmoc-His-Aib-OH,R1，叔丁酯在后一步脱Trt过程中可以同时脱掉，可一锅法得到目标物；且路线短，产率更高，纯度高；单杂可以在0.10％以下，异构体杂质可以控制在0.05％以下，适合工业化生产；本发明制备方法可以为索马鲁肽及其它多肽类产品提供高纯度修饰片段，减轻修饰后的纯化压力。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的技术方案及其所产生的技术效果作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
对比例1：
重复专利CN108059666B实施例2方法
Fmoc-His(Trt)-OH(5.0g)，投到20ml THF中，降温至5℃以下。将DCC溶解在THF中，然后滴加到Fmoc-His(Trt)-OH的THF溶液中，保温反应1小时后升温至25℃，保温反应至TLC显示原料Fmoc-His(Trt)-OH消失。过滤，将滤液滴到含有碳酸钠、2-氨基异丁酸的THF和水的混合溶剂中，HPLC跟踪反应，发现Fmoc-His-Aib-OH占40％左右，Fmoc-His(Trt)-OH占40％左右。
实施例1：Fmoc-His-Aib-OH,TFA的制备
向DCM中投入Fmoc-His(Trt)-OH(100.0g)，搅拌至体系澄清后降至0℃。投入HBTU(61.3g)、DIEA(31.28g)，搅拌30min。继续投入EDC(30.97g)，搅拌1h。TLC显示没有明显Fmoc-His(Trt)-OH即可。反应结束，继续投入H-Aib-OtBu.HCl(47.37g)。投毕，0℃反应1小时，20℃反应3小时。反应结束后，反应液用水淬灭。分液，取有机相。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，取有机相。有机相用水洗涤，分液，取有机相，浓缩有机相得到浓缩物直接用于下一步。
25℃室温条件下，向上一步得到的浓缩物中投入TFA(134.86g)，TIPS(18.73g)，保温反应5小时，反应结束后，浓缩，向浓缩物中加入正庚烷，分液，取下层液体，下层液体加入乙腈浓缩至2-3倍Fmoc-His(Trt)-OH重量浓缩结束后，向浓缩物中投入乙腈、MTBE。15-25℃搅拌析晶。经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体58.7g，纯度99.94％，其它最大单个杂质0.03％异构体杂质0.046％，IC-F3COO-：20.63％。两步总收率65.0％。质谱：[m+1]/e＝463.07；1H-NMR(400MHz,CD3OD)：δ(ppm)8.75(s,1H)，7.77(d,2H)，7.60(d,2H),7.37(t,2H)，7.37(t,3H)，4.44(t,1H)，4.36(d,2H)，4.16(t,1H)，3.30(d,1H)，3.18(d,1H)，3.05(d,1H)，1.50(s,3H)，1.45(s,3H)。2.57-2.50(m,2H)
实施例2：Fmoc-His-Aib-OH,TFA的制备
向DCM中投入Fmoc-His(Trt)-OH(10.0g)，搅拌至体系澄清后降至-10℃。投入HOBt(2.2g)、DIEA(3.1g)，搅拌30min。继续投入EDC(3.1g)，搅拌1h。TLC显示没有明显原料点即可。反应结束，继续投入2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(4.7g)。投毕，-10℃反应1小时，20℃反应3小时。反应结束后，反应液用水淬灭。分液，取有机相。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，取有机相。有机相用水洗涤，分液，取有机相，浓缩有机相得到浓缩物直接用于下一步。
15-25℃室温条件下，向上一步得到的浓缩物中投入TFA(13.4g)，TIS(1.9g)，保温反应5小时，反应结束后，浓缩，向浓缩物中加入正庚烷，分液，取下层液体，下层液体加入乙腈浓缩至2-3倍Fmoc-His(Trt)-OH重量浓缩结束后，向浓缩物中投入乙腈、MTBE。15-25℃搅拌析晶。经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体4.8g。两步总收率53.3％。纯度99.94％，其它最大单个杂质0.04％，异构体杂质0.047％。
实施例3：Fmoc-His-Aib-OH,TFA的制备
向THF中投入Fmoc-His(Trt)-OH(10.0g)，搅拌至体系澄清后降至10℃。投入HBTU(6.1g)、DIEA(3.1g)，搅拌30min。继续投入EDC(3.1g)，搅拌1h。TLC显示没有明显原料点即可。反应结束，继续投入2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(4.7g)。投毕，0℃反应1小时，20℃反应3小时。反应结束后，反应液用水淬灭。分液，取有机相。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，取有机相。有机相用水洗涤，分液，取有机相，浓缩有机相得到浓缩物直接用于下一步。
室温条件下，向上一步得到的浓缩物中投入TFA(13.4g)，TIS(1.9g)，保温反应5小时，反应结束后，浓缩，向浓缩物中加入正庚烷，分液，取下层液体，下层液体用加入乙腈浓缩至2-3倍Fmoc-His(Trt)-OH重量，浓缩结束后，向浓缩物中投入乙腈、MTBE。15-25℃搅拌析晶。经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体5.4g。两步总收率59.8％。纯度99.92％，其它最大单个杂质0.05％，异构体杂质0.045％。
实施例4：Fmoc-His-Aib-OH,HCl的制备
向二氧六环中投入Fmoc-His(Trt)-OH(10.0g)，搅拌至体系澄清后降至10℃。投入HBTU(6.1g)、DIEA(3.1g)，搅拌30min。继续投入EDC(3.1g)，搅拌1h。TLC显示没有明显原料点即可。反应结束，继续投入2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(4.7g)。投毕，0℃反应1小时，20℃反应3小时。反应结束后，反应液用水淬灭。分液，取有机相。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，取有机相。有机相用水洗涤，分液，取有机相，浓缩有机相得到浓缩物直接用于下一步。
室温条件下，向上一步得到的浓缩物中投入盐酸(13.4g)，TIS(1.9g)，保温反应5小时，反应结束后，浓缩，向浓缩物中加入正庚烷，分液，取下层液体，下层液体加入乙腈浓缩至2-3倍Fmoc-His(Trt)-OH重量，浓缩结束后，向浓缩物中投入乙腈、MTBE。15-25℃搅拌析晶。经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体5.8g。两步总收率62.3％。纯度99.94％，其它最大单个杂质0.06％，异构体杂质0.047％。
实施例5：Fmoc-His-Aib-OH,TFA的制备
向DCM中投入Fmoc-His(Trt)-OH(10.0g)，搅拌至体系澄清后降至10℃。投入HOBt(2.2g)、DIEA(3.1g)，搅拌30min。继续投入EDC(3.1g)，搅拌1h。TLC显示没有明显原料点即可。反应结束，继续投入2-氨基异丁酸叔丁酯盐酸盐(4.7g)。投毕，0℃反应1小时，20℃反应3小时。反应结束后，反应液用水淬灭。分液，取有机相。有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，分液，取有机相。有机相用水洗涤，分液，取有机相，浓缩有机相得到浓缩物直接用于下一步。
室温条件下，向上一步得到的浓缩物中投入TFA(13.4g)，TIS(1.9g)，保温反应5小时，反应结束后，浓缩，向浓缩物中加入正庚烷，分液，取下层液体，下层液体用加入乙腈浓缩至2-3倍Fmoc-His(Trt)-OH重量，浓缩结束后，向浓缩物中投入乙腈、MTBE。15-25℃搅拌析晶。经过滤、洗涤、干燥，得到白色固体5.9g。两步总收率63.3％。纯度99.90％，其它最大单个杂质0.06％，异构体杂质0.044％。