技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种驴骨胶原蛋白来源的抗氧化肽、其制备方法、及其在抗骨质疏松方面的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
每年由于驴皮、驴肉的生产利用，有大量的驴骨产生，但只有少量驴骨被制成驴骨粉加以应用，大多被丢弃，造成严重的环境污染和资源浪费。研究发现，驴骨中含有丰富的胶原蛋白。胶原蛋白具有抗氧化、保湿、降压等作用。
骨质疏松症是多基因调控、强遗传性、以低骨量和高骨折危险性为特点的疾病。骨质疏松症是一种全身性代谢性骨病，是由于破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间失衡引起的。据世界卫生组织资料显示，其严重性仅次于心血管疾病，患病后果是疼痛、失去活动能力、生活不能自理，突发时也会导致死亡。因此，骨质疏松症经典的药物治疗一般采用抗骨吸收药(如二膦酸盐类)和促骨形成药物(甲状旁腺激素等)。实际应用表明，这些药物毒副作用强，不能长期使用。
驴骨胶原蛋白已被验证可以用于改善骨质疏松大鼠，但具体机制尚不明确，研究表明，氧化应激或为骨质疏松治疗的一个重要靶点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种驴骨胶原蛋白肽经胃肠消化产生的抗氧化肽。该抗氧化肽的抗氧化活性较全面，可以抵抗DPPH自由基、羟自由基、ABTS阳离子和超氧阴离子。该抗氧化肽可以有效保护成骨细胞免受双氧水的损伤，具有非常优秀的抗骨质疏松的潜力。本发明通过模拟体内消化，并对酶解产物进行超滤、阴离子交换色谱洗脱、凝胶排阻色谱洗脱、反相高效液相色谱洗脱、质谱测序等一系列处理，得到7条具有潜在抗骨质疏松活性的抗氧化肽，并得到其准确序列。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种驴骨胶原蛋白来源的具有抗骨质疏松的抗氧化肽的制备方法，包括：
将驴骨胶原蛋白依次采用胃蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，固液分离、冻干，得到消化产物；
将所述消化产物进行超滤、阴离子交换色谱洗脱、凝胶排阻色谱洗脱、反相高效液相色谱洗脱、质谱测序，筛选出具有潜在抗骨质疏松活性的抗氧化肽，即得。
本发明从胶原蛋白抗氧化的角度，探究驴骨胶原蛋白的食药价值。以一种模拟体内消化的酶解方式并对酶解产物分离纯化，探究驴骨胶原蛋白经胃肠消化后产生的抗氧化肽，探究驴骨胶原蛋白肽抗骨质疏松的潜在活性，为驴骨的开发及应用奠定理论基础。
本发明的第二个方面，提供了上述的方法筛选出的肽段，所述肽段包括：序列分别为ANLGPA、HYFL、PAEGPA、KLLHA、HVPNA、GGWFL、GWFK。
本发明的第三个方面，提供了上述的肽段在在抵抗DPPH自由基、羟自由基、ABTS阳离子和超氧阴离子，保护成骨细胞免受H2O2的氧化损伤中的应用。
本发明的有益效果
(1)本发明通过模拟胃肠消化时间、pH和转速，探究驴骨胶原蛋白经胃肠产生的具有生物活性的抗氧化肽。
(2)针对分离纯化的研究中，本发明提供了一种可针对该酶解产物的分离纯化方法，基于本发明的方法，本领域技术人员可依据应用目的和需求对所述酶解物进行分离制备，能够灵活满足工业上的多种应用目的。
(3)本发明制备方法简单、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例采用的驴骨胶原蛋白的傅里叶红外吸收图谱；
图2为本发明实施例2的阴离子交换色谱图；
图3为本发明实施例2的凝胶排阻色谱图；
图4为本发明实施例3的7种短肽对成骨细胞的毒性作用图；
图5为本发明实施例3的7种短肽对成骨细胞的保护作用图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，驴骨中含有丰富的胶原蛋白。胶原蛋白具有抗氧化、保湿、降压等作用。氧化应激或为骨质疏松治疗的一个重要靶点，本发明从胶原蛋白抗氧化的角度，探究驴骨胶原蛋白的食药价值。以一种模拟体内消化的酶解方式并对酶解产物分离纯化，探究驴骨胶原蛋白经胃肠消化后产生的抗氧化肽，探究驴骨胶原蛋白肽抗骨质疏松的潜在活性，为驴骨的开发及应用奠定理论基础。
一种驴骨胶原蛋白体外模拟体内消化的酶解过程，所述驴骨胶原蛋白经胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解，用以模拟人体胃肠消化。
其次，本发明还提供对所述消化产物进行超滤、阴离子交换色谱洗脱、凝胶排阻色谱洗脱、反相高效液相色谱洗脱、质谱测序等一系列处理，得到7条具有潜在抗骨质疏松活性的抗氧化肽，序列为ANLGPA、HYFL、PAEGPA、KLLHA、HVPNA、GGWFL、GWFK。
基于上述研究成果，本发明提供的抗氧化肽的抗氧化活性较全面，可以抵抗DPPH自由基、羟自由基、ABTS阳离子和超氧阴离子，保护成骨细胞免受H2O2的氧化损伤，具有潜在的抗氧化活性。
在一些实施例中，所述反应中的驴骨胶原蛋白在228nm处有最大吸收峰，分子量在5kDa和245kDa间呈弥散分布，其特征红外吸收图谱如图1所示。所述的胃蛋白酶的酶活力大于或等于1200.0U/g，胰蛋白酶的酶活为4×usp规格。
在一些实施例中，胃蛋白酶与驴骨胶原蛋白的反应条件为：胃蛋白酶与驴骨胶原蛋白的质量比为1：35～40，于37～38℃、pH为2.0±0.1下，振荡反应1～1.5h。
在一些实施例中，胰蛋白酶与驴骨胶原蛋白的反应条件为：胰蛋白酶与驴骨胶原蛋白的质量比为1：25～30，于37～38℃、pH为7.0±0.1下，振荡反应2～3h。
在一些实施例中，胃蛋白酶与驴骨胶原蛋白(DC)的反应比例为1：35(w/w),反应时间为1h，反应温度为37℃，反应pH为2.0±0.1，振荡器转速为100rpm/min。NaOH调节pH至7.0±0.1终止胃蛋白酶反应，再以酶与蛋白1：25(w/w)的比例加入胰蛋白酶，反应时间为2h，反应温度为37℃，振荡器转速为100rpm/min。沸水浴10min终止胰蛋白酶反应，8000rpm/min条件下离心15min，取上清，冷冻干燥，得酶解产物DCH。
一种上述酶解产物的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：超滤、阴离子交换色谱洗脱、凝胶排阻色谱洗脱、反相高效液相色谱洗脱、质谱测序。
在一些实施例中，所述超滤得纯化方法，选用的超滤截留面为3kDa和10kDa，得到三个组分，即为MW>10kDa的DCH-a、10kDa>MW>3kDa的DCH-b和MW<3kDa的DCH-c。检测3个组分对DPPH自由基的清除活性，以此筛选抗氧化活性最高的组分用于下一步纯化。
在一些实施例中，所述超滤中抗氧化活性最高组分，富集后经阴离子交换色谱(DEAE-52)纯化，分别用蒸馏水、2mM、5mM、10mM、50mM和100mM NaCl溶液洗脱，5mL/min的流速，214nm检测，得到DCHc-A、DCHc-B、DCHc-C、DCHc-D和DCHc-E共5个组分。检测5个组分对DPPH自由基的清除活性，以此筛选抗氧化活性最高的组分用于下一步纯化。
在一些实施例中，所述阴离子交换色谱洗脱中抗氧化活性组分，富集后经凝胶排阻色谱(G-25)纯化，蒸馏水洗脱，5mL/min的流速，214nm检测，得到DCHcA-1、DCHcA-2、DCHcA-3和DCHcA-4共4个组分，检测4个组分对DPPH自由基的清除活性，以此筛选抗氧化活性最高的组分用于下一步纯化。
在一些实施例中，所述凝胶排阻色谱洗脱中抗氧化活性组分，富集后经反相高效液相色谱(C-18)纯化，蒸馏水洗脱，5％～30％乙腈梯度洗脱，0.4mL/min洗脱20min，收集214nm处的组分，得到DCHcA3-α和DCHcA3-β两个组分，检测2个组分对DPPH自由基的清除活性，以此筛选抗氧化活性最高的组分用于下一步实验。
在一些实施例中，所述C-18色谱洗脱中抗氧化活性组分，富集后进行质谱测序。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下实施例中，采用的驴骨胶原蛋白在228nm处有最大吸收峰，分子量在5kDa和245kDa间呈弥散分布，其特征红外吸收图谱如图1所示。
胃蛋白酶的酶活力大于或等于1200.0U/g，胰蛋白酶的酶活为4×usp规格。
实施例1
本实施例中，提供一种体外模拟体内消化，对驴骨胶原蛋白(DC)酶解的方法：
取1g DC溶于75mL蒸馏水，用6mol/L的浓盐酸调节pH至2.0±0.1，按1：35(酶：底物，w/w)的比例加入胃蛋白酶，37℃，100rpm/min，振动1h。调节体系pH至7.0±0.1，75mL蒸馏水，按1：25(酶：底物，w/w)的比例加入胰蛋白酶，37℃，100rpm/min，振动2h。沸水浴10min灭活，冷却，8000rpm/min离心，取上清冻干。酶解样品DCH相较于DC，样品的抗氧化性有很大提高，体内消化释放了胶原蛋白的抗氧化活性。
实施例2
本实施例中，提供了实施例1制备的酶解产物DCH中抗氧化肽的纯化方法：
S1：选择截留分子量为3KDa和10KDa的超滤管对DCH进行超滤，得到DCH-a(>10KDa)、DCH-b(3KDa-10KDa)和DCH-c(<3KDa)，其中，相较于DCH-a和DCH-b，DCH-c对DPPH自由基的清除活性最好。选用DCH-c进行下一步纯化。
S2：选用阴离子交换柱(DEAE-52)对DCH-c进行进一步纯化，用蒸馏水、2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L和100mmol/L的NaCl溶液洗脱样品，得到DCHc-A、DCHc-B、DCHc-C、DCHc-D和DCHc-E五个样品，其中DCHc-A组分对DPPH自由基有更高的清除活性。选择DCHc-A进行下一步纯化。
S3：用凝胶排阻色谱(G-25)对DCHc-A进行进一步纯化，用蒸馏水洗脱，得到DCHcA-1、DCHcA-2、DCHcA-3和DCHcA-4四个组分，其中组分DCHcA-3对DPPH自由基有更高的清除活性。选择DCHcA-3进行下一步纯化。
S4：用反相液相高效色谱(C-18)对DCHcA-3进行进一步纯化，A相，蒸馏水、B相、乙腈，5％～30％B，20min，0.4mL/min。收集DCHcA3-α和DCHcA3-β两个组分，选择DCHcA3-α进行质谱分析，参照其相对丰度、分子量、比对标准得分等指标筛选出7条具有较高抗氧化活性的肽段，序列分别为ANLGPA、HYFL、PAEGPA、KLLHA、HVPNA、GGWFL、GWFK。
实施例3
本实施例中，还针对上述抗氧化肽ANLGPA(AA-6)、HYFL(HL-4)、PAEGPA(PA-6)、KLLHA(KA-5)、HVPNA(HA-5)、GGWFL(GL-5)、GWFK(GK-4)的抗氧化活性进行更为全面的评价：
(1)7种短肽对羟自由基的清除活性：分别配制浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1mg/mL的样品溶液，以GSH作阳性对照。取样品100μL，加入8mmol/L的FeSO4溶液30μL，3mmol/L的水杨酸100μL，20mmol/L的H2O2溶液25μL，蒸馏水定容至300μL。37℃条件下反应30min，流水冷却至室温，3000rpm/min的条件下离心10min，取上清液在510nm处测定样品的吸光度，以不加样品的空白组作为空白对照，计算样品对羟自由基的清除率。结果表明，1mg/mL时，KA-5、HA-5、AA-6、PA-6、HL-4、GL-5、GK-4和GSH对羟自由基的清除率分别为(24.05±2.65)、(19.79±0.25)、(4.33±2.80)、(2.49±1.41)、(0.36±0.32)、(0.26±1.37)、(-0.29±2.33)和(27.56±5.44)％。
(2)7种短肽对ABTS阳离子的清除活性：分别配制浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1mg/mL的样品溶液，以GSH作阳性对照。先将7mmol/LABTS原液5mL与2.45mmol/L过硫酸钾5mL混合，室温黑暗放置16h，得到ABTS阳离子溶液，然后用5mmol/L PBS稀释，使其在734nm处的吸光度为0.70±0.02。取样品100μL与ABTS阳离子溶液100μL反应，室温条件下孵育10min，在酶标仪734nm处测定样品的吸光度，以不加样品的空白组作为空白对照，计算样品对ABTS阳离子的清除率。结果表明，1mg/mL时，GL-5、HL-4、GK-4、AA-6、KA-5、HA-5、PA-6和GSH对ABTS阳离子的清除率为(100.37±0.25)、(100.25±0.33)、(99.54±0.44)、(69.22±1.13)、(3.55±1.84)、(0.02±0.69)、(-2.60±5.40)和(100.42±0.19)。
(3)7种短肽对DPPH自由基的抑制活性：分别配制浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1mg/mL的样品溶液，以GSH作阳性对照。取0.02％DPPH自由基乙醇溶液125μL，各浓度样品500μL，室温避光孵育1h，517nm处检测样品吸光度。以不加样品的空白组作为空白对照，计算样品对DPPH自由基的抑制率。结果表明，1mg/mL时，AA-6、GL-5、GK-4、KA-5、HA-5、PA-6、HL-4和GSH对DPPH自由基的清除率分别为(49.46±6.37)、(43.23±9.12)、(34.05±1.66)、(27.10±3.65)、(22.90±6.84)、(22.06±23.20)、(6.15±5.22)和(90.49±2.17)％。
(4)7种短肽对超氧阴离子的清除活性：分别配制浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5和1mg/mL的样品溶液，以GSH作阳性对照。加入72μM氯化硝基四氮唑蓝(NBT)50μL，338μM的还原型辅酶Ⅰ(NADH)50μL，30μM酚嗪甲硫酸盐溶液(PMS)50μL，样品50μL。室温条件下孵育5min，检测样品在560nm处的吸光度。结果表明，1mg/mL时，HA-5、PA-6、GK-4、KA-5、HL-4、GL-5、AA-6和GSH对超氧阴离子的清除率分别为(101.66±0.21)、(101.11±0.24)、(99.86±0.48)、(99.59±0.36)、(99.31±0.43)、(99.10±0.12)、(98.55±0.21)和(100.14±0.12)％。
(5)7种短肽对MC3T3-E1的毒性作用(CCK-8)：取适量样品溶于PBS中，配制成的母液，用0.22μm的无菌滤膜过滤后，4℃保存。实验时，用新鲜的培养基将2.5mg/mL的样品稀释成5、10、20、50、100和150μg/mL。N-乙酰半胱氨酸：在PBS中溶解适量的NAC，配制成母液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存，备用。实验时，用完全培养基将50mmol/L NAC稀释成1mmol/L，作为阳性对照组。取对数生长期细胞，计数板计数，将细胞密度稀释为1×104个/mL，接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养6～8h。细胞贴壁后，弃去旧培养基，将含有不同浓度的样品的新鲜培养基加入96孔板，100μL每孔，孵育24h。弃去培养基，用新鲜培养基或PBS将96孔板清洗两遍，加入新鲜培养基，每孔100μL，再向每孔加入10μL CCK-8反应液，避光，细胞培养箱中反应1～2h，酶标仪下检测450nm处吸光度。A阴为阴性对照，只含培养基和检测用试剂；A空为无样品孵育的细胞；A样为实验组。每组设置6个复孔，样品对细胞的毒性作用按照公式((A样-A阴)/(A空-A阴)×100％)计算，结果如图4所示
(6)建立氧化损伤模型(CCK-8法)：H2O2的配制：PBS稀释30％H2O2，配制成10mmol/L的母液，用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌后，4℃保存。实验时，用完全培养基将母液稀释成800、700、600、500、400、300、200、100和50μmol/L。取对数生长期细胞，计数板计数，将细胞密度稀释为1×104个/mL，接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养6～8h。细胞贴壁后，弃去旧培养基，添加新鲜培养基，100μL每孔，孵育24h。弃去培养基，将含有不同浓度H2O2的新鲜培养基加入到96孔板中，每孔100μL，细胞培养箱中孵育4h，弃去培养基，用新鲜培养基或PBS将96孔板清洗两遍，加入新鲜培养基，每孔100μL，再向每孔加入10μL CCK-8反应液，避光，细胞培养箱中反应1～2h，酶标仪下检测450nm处吸光度。A阴为阴性对照，只含培养基和检测用试剂；A空为无样品孵育的细胞；A样为实验组，并根据公式((A样-A阴)/(A空-A阴)×100％)测定各组细胞存活率。
(7)7种短肽对成骨细胞的保护作用(CCK-8法)：取对数生长期细胞，计数板计数，将细胞密度稀释为1×104个/mL，接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养6～8h。细胞贴壁后，弃去旧培养基，添加含有不同浓度样品的新鲜培养基，100μL每孔，孵育24h。弃去培养基，将选定浓度的H2O2加入到96孔板中，每孔100μL，H2O2处理4h，弃去含有H2O2的旧培养基，用PBS将96孔板清洗两遍，更换新鲜培养基，100μL每孔，再按照10μL/100μL的比例添加CCK-8反应液，细胞培养箱中避光反应1～2h，酶标仪下检测450nm处吸光度。根据A阴为阴性对照，只含培养基和检测用试剂；A空为无样品孵育的细胞；A样为实验组，并根据公式((A样-A阴)/(A空-A阴)×100％)测定各组细胞存活率，测试结果如图5所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。