技术领域
本发明属于检测试剂原料制备领域，具体涉及用于检测联苯吡菌胺的关键原料及其制备方法与应用。
背景技术
联苯吡菌胺是一种吡唑酰胺类化合物，英文通用名bixafen，中文化学名N-(3',4'-二氯-5-氟联苯基-2-基)-3-(二氟甲基)-1-甲基吡唑-4-酰胺，主要用作杀菌剂，作为琥珀酸脱氢酶抑制剂中的一员，其作用于病原菌线粒体呼吸电子传递链上的复合体Ⅱ，抑制线粒体功能，阻碍其能量的代谢，抑制病原菌生长，最终导致病原菌死亡。联苯吡菌胺拥有联苯基吡唑酰胺化学结构，可用于诸多作物，防治由子囊菌、担子菌、半知菌引起的重要病害，在谷物上的应用较多，能防治小麦叶枯病、叶锈病、条锈病等，以及大麦网斑病、柱隔孢叶斑病、云纹病等，并能防治对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗性的壳针孢属病原菌引起的叶斑病等，联苯吡菌胺对大麦网斑病、苹果白粉病也有很好的治疗和保护效果。此外，联苯吡菌胺还能与多种杀虫杀菌剂进行复配，降低脱靶损失，减少对环境的影响。
作为一种广泛应用的杀菌剂，联苯吡菌胺对大鼠的急性毒性为经口LD50＞5000mg/kg，经皮LD50＞5000mg/kg，吸入LC50＞5.383mg/L，大、小鼠慢性毒性NOAEL为6.7mg/(kg·d)，对水生生物和土壤生物同样会造成毒害。蛋鸡和哺乳山羊的动物组织、乳汁和蛋中会含有较高未分解的母体化合物，在黑暗的实验室测试中，有氧和无氧条件下土壤中联苯吡菌胺的半衰期DT50＞1年，在一般环境条件下，不易水解和光解。
目前对于联苯吡菌胺的检测主要采用色谱或质谱方式，如高效液相色谱、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱等，补充以生物化学为基础的检测能够更好的完善联苯吡菌胺的定量检测分析技术。
公开号为CN104713977A，申请日为2015年1月9日的中国专利公开了葡萄酒中多种吡唑类杀菌剂的固相萃取-液相色谱-串联质谱检测方法，能够同时测定葡萄酒中样品中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、联苯吡菌胺、呋吡菌胺6种吡唑类杀菌剂，为评价葡萄酒样品质量提供了新的检测方法；公开号为CN109187785A，2018年9年13日的中国专利公开了一种莲子中农药联苯吡菌胺的定量检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱法进行分析检测莲子样品待测液，计算待测液中联苯吡菌胺的测定值，此发明在检测莲子中农药联苯吡菌胺的残留含量方面具有准确性高、效率高、易于操作等优点，填补了我国在莲子中新型农药联苯吡菌胺的检测技术上的空白。但是上述两种检测方法仅适用于葡萄酒样品或莲子中农药样品中，无法检测其他农产品或农副产品，应用的场景比较单一。
因此，综上所述开发一种应用场景广泛，能对联苯吡菌胺的含量进行精确快捷检测的原料有着十分重要的实用意义和巨大的应用潜力。
发明内容
为解决现有技术中的缺陷，本发明提供用于检测联苯吡菌胺的关键原料及其制备方法与应用，以免疫反应为基础对联苯吡菌胺进行检测的过程中，获得以碳长链羧基端为基础特征的三种关键原料，其皆保留了联苯吡菌胺的联苯基吡唑酰胺特征化学结构，能与各类载体有较好的连接，从而获得既具有免疫反应性，又具有免疫原性的原料-载体复合物，也称为完全抗原，此原料-载体复合物能通过动物免疫进程制备出大量特异性抗体，获得应用广泛的免疫检测试剂条，对各类场景中联苯吡菌胺的检测均较为灵敏。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的之一在于提供用于检测联苯吡菌胺的关键原料，所述关键原料的结构如式Ⅰ所示：
本发明的目的之二在于提供用于检测联苯吡菌胺的关键原料的制备方法，所述原料1的制备方法步骤如下：
L11.将2-氯-4-碘甲苯、(2-氨基-5-氟苯基)硼酸置于甲苯中，加热到60-70℃，回流12-16h，结束后自然冷却降至室温，加入聚丙烯酸甲酯溶液，以60-80rpm的搅拌速度反应15-20h，50-60℃下旋蒸3-5h，然后使用95％无水乙醇清洗2-3次，获得物质A；
L12.将步骤L11获得的物质A与3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯混合，加入二氯甲烷，在室温下以40-60rpm的搅拌速度反应20-60min，控制温度在10-25℃下旋蒸3-5h，加入蒸馏水并加热至50-60℃，维持1-2h后，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩后用闪式硅胶柱色谱法进行纯化，其中三氯甲烷：甲醇＝20-25：1，获得原料1。
进一步的，所述步骤L11中2-氯-4-碘甲苯：(2-氨基-5-氟苯基)硼酸：甲苯：聚丙烯酸甲酯溶液的质量体积比为1-1.5：0.8-1.4：230-260：30-50；
进一步的，所述步骤L12中物质A：3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯：二氯甲烷：蒸馏水的质量体积比为1-3：2-4：100-140：50-80。
本发明中所述关键原料的结构还可以如式Ⅱ所示：
本发明中原料2的制备方法步骤如下：
L21.将3-溴丁酸乙酯与5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯置于丙酮中，在室温下以60-90rpm的搅拌速度反应2-4h，蒸馏水洗涤3-4次，加入75％无水乙醇以60-90rpm的搅拌速度维持1-2h，蒸发去除无水乙醇，60-80℃烘干后获得物质B；
L22.将步骤L21获得的物质B与2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯混合，加入二氯甲烷，室温下以40-60rpm的搅拌速度反应0.5-1h，10-25℃下旋蒸3-5h，获得物质C；
L23.将步骤L22获得的物质C与碘甲烷反应置于N,N-二甲基甲酰胺中，常温下反应1-2h，20-30℃下旋蒸3-4h，然后90-100℃继续旋蒸2-4h，加入75％无水乙醇在常温下停留30-60min，蒸馏水洗涤2-5次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩后用闪式硅胶柱色谱法进行纯化，其中三氯甲烷：甲醇＝30-40：1，获得原料2。
进一步的，所述步骤L21中3-溴丁酸乙酯：5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯：丙酮：75％无水乙醇的质量体积比为1-2：1-3：140-180：120-160；
进一步的，所述步骤L22中物质B：2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯：二氯甲烷的质量体积比为0.8-1.3：1-2：150-180；
进一步的，所述步骤L23中物质C：碘甲烷：N,N-二甲基甲酰胺：75％无水乙醇的质量体积比为1.2-1.5：2-3：80-120：100-140。
本发明中所述关键原料的结构还可以如式Ⅲ所示：
本发明中原料3的制备方法步骤如下：
L31.将2-溴-4-氟苯胺与4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸置于乙二醇二甲醚中，保持温度70-80℃，回流0.5-1h，加入蒸馏水，在60-80℃下旋蒸4-5h，获得物质D；
L32.将步骤L31获得的物质D，与3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯进行反应，具体是在室温下，二氯甲烷中以80-100rpm搅拌2-3h，10-25℃下旋蒸3-5h，然后加入75％无水乙醇并停留0.5-1h，蒸馏水洗涤2-5次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩后用闪式硅胶柱色谱法进行纯化，其中三氯甲烷：甲醇＝50-60：1，获得原料3。
进一步的，所述步骤L31中2-溴-4-氟苯胺：4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸：乙二醇二甲醚：蒸馏水的质量体积比为2-4：3-5：100-120：160-180；
进一步的，所述步骤L32中物质D：3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯：二氯甲烷：75％无水乙醇的质量体积比为0.5-1.0：1-1.2：80-130：100-120。
本发明的目的之三在于提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的应用，所述检测联苯吡菌胺包括以下内容：
S1.合成原料-载体复合物：采用碳二亚胺法、混合酸酐法、N－羟基丁二酰亚胺活性酯法中的任一种，将所述关键原料与具有丰富氨基基团，能与关键原料羧基发生缩合反应的载体进行连接，合成具有免疫反应性，又具有免疫原性的原料-载体复合物；
S2.制备抗体：将S1中合成的原料-载体复合物输入动物体内，利用动物自身的体液免疫应答机制获得的抗体；
S3.检测联苯吡菌胺：利用关键原料或原料-载体复合物制备免疫检测试剂条，将待测联苯吡菌胺样品滴入免疫检测试剂条，静置使免疫反应信号被转化为颜色或荧光信息，借助相应仪器进行定量或定性分析。
进一步的，所述S1中载体可选择牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、人血清蛋白、兔血清蛋白、钥孔血蓝蛋白以及人工合成的多聚赖氨酸中的任一种。
进一步的，载体不限制天然来源或人工合成。
进一步的，所述S2中抗体不限制是单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步的，所述S3中免疫检测试剂条是利用免疫反应原理，采用竞争法或非竞争法制备的快速检测的试纸条，联苯吡菌胺检测试剂关键原料可作为包被原或免疫原使用；
进一步的，所述S3中待测联苯吡菌胺样品不限于农产品或农副产品，不限于使用过联苯吡菌胺后的土壤或水体，任何需要检测残留联苯吡菌胺的场景均可应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明采用计算化学的方法对联苯吡菌胺本身结构进行分析，在保留其特征结构的基础上模拟可能的联苯吡菌胺检测试剂关键原料结构，将一系列联苯吡菌胺检测试剂关键原料结构经计算化学结构优化，稳定性等分析，首次获得三种能维持联苯吡菌胺的联苯基吡唑酰胺化学结构的关键原料，即原料1、原料2、原料3，并开发原料1、原料2、原料3相应的制备方法，且制备方法具有原料易得，产物纯度较高的优势。
2、本发明提供的三种检测联苯吡菌胺的关键原料既与联苯吡菌胺有相似性，又能弥补联苯吡菌胺不能和载体直接相连的问题，与载体较好地结合而获得免疫反应性较好，免疫原性较强的原料-载体复合物，且原料-载体复合物能同样保持住联苯吡菌胺的特征结构，克服了联苯吡菌胺本身仅具有免疫反应性，即仅能与抗体结合，但不引发抗体产生的问题。与高效液相色谱、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱等现有免疫检测手段相比，本发明所提供的关键原料在检测联苯吡菌胺的应用中特异性较强，效果较佳。
3、本发明所述检测联苯吡菌胺的应用中以免疫反应为基础进行检测，采用动物免疫获得的抗体，与联苯吡菌胺结合能力较强，且不易与其他具有相似化学结构且作用原理一致的杀菌剂产生交叉反应，能精准辅助各种场合下联苯吡菌胺的检测，而不必考虑其他杀菌剂是否存在。同时此检测方法的应用场景不限于农产品或农副产品，不限于使用过联苯吡菌胺后的土壤或水体，适合任何需要检测残留联苯吡菌胺的场景，具有广泛良好的应用范围与应用前景。
附图说明
图1为本发明所述用于检测联苯吡菌胺关键原料的结构式，其中(a)为原料1，(b)为原料2，(c)为原料3；
图2为本发明所述用于检测联苯吡菌胺关键原料相应制备方法中物质A、B、C、D的结构式，其中(A)为物质A，(B)为物质B，(C)为物质C，(D)为物质D；
图3为本发明性能测试中关键原料的核磁共振氢谱图，其中(a)为原料1，(b)为原料2，(c)为原料3。
具体实施方式
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
下述实施例1-3的试剂来源：2-氯-4-碘甲苯(CAS：83846-48-4)，固体，纯度97％；
(2-氨基-5-氟苯基)硼酸(CAS：1040400-87-0)，固体，纯度97％，均购买自上海迈瑞尔生化科技有限公司；
聚丙烯酸甲酯溶液，液体，纯度为average Mw～40,000by GPC，购买自上海迈瑞尔生化科技有限公司；
3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯(CAS：141573-96-8)，固体，纯度95％，购买自深圳爱拓化学有限公司；
甲苯，液体，纯度99.8％、二氯甲烷，液体，纯度99.8％，均购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
下述实施例4-6的试剂来源：3-溴丁酸乙酯(CAS：7425-49-2)，固体，纯度95％，购买自上海迈瑞尔生化科技有限公司；
5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯(CAS：151733-96-9)，固体，纯度95％，购买自上海毕得医药科技股份有限公司；
2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯(CAS：877179-04-9)，固体，纯度95％，购买自上海麦克林生化科技股份有限公司；
碘甲烷(CAS：74-88-4)，固体，纯度99％，购买自湖南汇百侍生物科技有限公司；
N,N-二甲基甲酰胺(CAS：68-12-2)，液体，纯度99.8％购买自上海迈瑞尔生化科技有限公司；
丙酮，液体，纯度99.5％、二氯甲烷，液体，纯度99.8％，均购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
下述实施例7-9的试剂来源：2-溴-4-氟苯胺(CAS：1003-98-1)，固体，纯度97％，购买自上海迈瑞尔生化科技有限公司；
4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸(CAS：660440-57-3)，固体，纯度98％，购买自上海麦克林生化科技股份有限公司；
3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯(CAS：141573-96-8)，固体，纯度95％，购买自深圳爱拓化学有限公司；
乙二醇二甲醚，液体，纯度99.5％、二氯甲烷，液体，纯度99.8％，均购买自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
下述实施例13-15中实验兔来自南方医科大学实验动物中心，为SPF级新西兰白兔，本实施例用实验兔两只，均为雌兔。
实施例1
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L11.称量1g 2-氯-4-碘甲苯，0.8g(2-氨基-5-氟苯基)硼酸置于230mL甲苯中，加热到60℃，回流12小时，结束后自然冷却至室温，加入30mL聚丙烯酸甲酯溶液，以60rpm的搅拌速度反15小时，50℃下旋蒸3小时，然后95％无水乙醇清洗2次，获得物质A；
L12.称量1g步骤L11获得的物质A，2g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯混合，加入100mL二氯甲烷，在室温下以40rpm的搅拌速度反应20分钟，在10℃下旋蒸3小时，加入50mL蒸馏水并加热到50℃，维持1小时，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝20：1进行纯化，获得原料1。
实施例2
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L11.称量1.2g 2-氯-4-碘甲苯，1g(2-氨基-5-氟苯基)硼酸置于245mL甲苯中，加热到65℃，回流14小时，结束后自然冷却至室温，加入40mL聚丙烯酸甲酯溶液，以70rpm的搅拌速度反18小时，55℃下旋蒸4小时，然后95％无水乙醇清洗2次，获得物质A；
L12.称量2g步骤L11获得的物质A，3g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯混合，加入120mL二氯甲烷，在室温下以50rpm的搅拌速度反应40分钟，在20℃下旋蒸4小时，加入65mL蒸馏水并加热到55℃，维持1.5小时，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝22：1进行纯化，获得原料1。
实施例3
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L11.称量1.5g 2-氯-4-碘甲苯，1.4g(2-氨基-5-氟苯基)硼酸置于260mL甲苯中，加热到70℃，回流16小时，结束后自然冷却至室温，加入50mL聚丙烯酸甲酯溶液，以80rpm的搅拌速度反20小时，60℃下旋蒸5小时，然后95％无水乙醇清洗3次，获得物质A；
L12.称量3g步骤L11获得的物质A，4g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯混合，加入140mL二氯甲烷，在室温下以60rpm的搅拌速度反应60分钟，在25℃下旋蒸5小时，加入80mL蒸馏水并加热到60℃，维持2小时，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝25：1进行纯化，获得原料1。
上述实施例1-3中原料1的结构如图1中(a)所示，物质A的结构如图2中(A)所示。
实施例4
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L21.称量1g 3-溴丁酸乙酯，1g 5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯置于140mL丙酮中，在室温下以60rpm的搅拌速度反应2小时，蒸馏水洗涤3次，加入120mL75％无水乙醇以60rpm的搅拌速度维持1小时，蒸发去除无水乙醇，60℃烘干后获得物质B；
L22.称量0.8g步骤L21获得的物质B，1g 2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯，加入150mL二氯甲烷，室温下以40rpm的搅拌速度反应0.5小时，10℃下旋蒸3小时，获得物质C；
L23.称量1.2g步骤L22获得的物质C，2g碘甲烷置于80mLN,N-二甲基甲酰胺中，常温下反应1小时，20℃下旋蒸3小时，然后90℃继续旋蒸2小时，然后加入100mL 75％无水乙醇在常温下停留30分钟，蒸馏水洗涤2次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝30：1进行纯化，获得原料2。
实施例5
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L21.称量1.5g 3-溴丁酸乙酯，2g 5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯置于160mL丙酮中，在室温下以70rpm的搅拌速度反应3小时，蒸馏水洗涤3次，加入140mL 75％无水乙醇以80rpm的搅拌速度维持1.5小时，蒸发去除无水乙醇，70℃烘干后获得物质B；
L22.称量1g步骤L21获得的物质B，1.4g 2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯，加入165mL二氯甲烷，室温下以50rpm的搅拌速度反应0.8小时，18℃下旋蒸4小时，获得物质C；
L23.称量1.3g步骤L22获得的物质C，2.5g碘甲烷置于100mLN,N-二甲基甲酰胺中，常温下反应1.5小时，25℃下旋蒸3.5小时，然后95℃继续旋蒸3小时，然后加入120mL75％无水乙醇在常温下停留45分钟，蒸馏水洗涤4次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝35：1进行纯化，获得原料2。
实施例6
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L21.称量2g 3-溴丁酸乙酯，3g 5-(二氟甲基)-1H-吡唑-4-羧酸乙酯置于180mL丙酮中，在室温下以90rpm的搅拌速度反应4小时，蒸馏水洗涤4次，加入160mL75％无水乙醇以90rpm的搅拌速度维持2小时，蒸发去除无水乙醇，80℃烘干后获得物质B；
L22.称量1.3g步骤L21获得的物质B，2g 2-氨基-5-氟-3,4,-二氯联苯，加入180mL二氯甲烷，室温下以60rpm的搅拌速度反应1小时，25℃下旋蒸5小时，获得物质C；
L23.称量1.5g步骤L22获得的物质C，3g碘甲烷置于120mL N,N-二甲基甲酰胺中，常温下反应2小时，30℃下旋蒸4小时，然后100℃继续旋蒸4小时，然后加入140mL 75％无水乙醇在常温下停留60分钟，蒸馏水洗涤5次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝40：1进行纯化，获得原料2。
上述实施例4-6中原料2的结构如图1中(b)所示，物质B的结构如图2中(B)所示，物质C的结构如图2中(C)所示。
实施例7
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L31.称量2g 2-溴-4-氟苯胺，3g 4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸置于100mL乙二醇二甲醚中，保持温度70℃，回流0.5小时，加入160mL蒸馏水，在60℃下旋蒸4小时，获得物质D；
L32.称量0.5g步骤L1获得的物质D，1g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯于80mL二氯甲烷中，室温下以80rpm的搅拌速度进行2小时，10℃下旋蒸3小时，然后加入100mL 75％无水乙醇并停留0.5小时，蒸馏水洗涤2次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝50：1进行纯化，获得原料3。
实施例8
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L31.称量3g 2-溴-4-氟苯胺，4g 4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸置于110mL乙二醇二甲醚中，保持温度75℃，回流0.8小时，加入170mL蒸馏水，在70℃下旋蒸4.5小时，获得物质D；
L32.称量0.8g步骤L1获得的物质D，1.1g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯于100mL二氯甲烷中，室温下以90rpm的搅拌速度进行2.5小时，20℃下旋蒸4小时，然后加入110mL 75％无水乙醇并停留0.8小时，蒸馏水洗涤3次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝55：1进行纯化，获得原料3。
实施例9
本实施例提供一种用于检测联苯吡菌胺关键原料的制备方法，其制备步骤如下：
L31.称量4g 2-溴-4-氟苯胺，5g 4-(3-乙氧基-3-羰基丙基)苯基硼酸置于120mL乙二醇二甲醚中，保持温度80℃，回流1小时，加入180mL蒸馏水，在80℃下旋蒸5小时，获得物质D；
L32.称量1g步骤L1获得的物质D，1.2g 3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-羰酰氯于130mL二氯甲烷中，室温下以100rpm的搅拌速度进行3小时，25℃下旋蒸5小时，然后加入120mL 75％无水乙醇并停留1小时，蒸馏水洗涤5次，采用无水硫酸镁进行干燥，过滤，真空浓缩，用闪式硅胶柱色谱法，三氯甲烷：甲醇＝60：1进行纯化，获得原料3。
上述实施例7-9中原料3的结构如图1中(c)所示，物质D的结构如图2中(D)所示。
实施例10
本实施例提供一种原料-载体复合物的制备方法，具体步骤如下：
S1.称量10mg实施例1制备的原料1、7mg NHS、11.6mg EDC于4mL DMF溶液中，室温下以80rpm的转速搅拌12小时，获得混合液A；
S2.将25mg鸡卵白蛋白溶于10mL 0.01M，pH＝7.4PBS缓冲液中，获得混合液B；
S3.将步骤S1获得的混合液A在4℃环境下滴加到步骤S2获得的混合液B中，结束后置于4℃以60rpm搅拌6小时，然后以2500g的离心力离心15分钟，将上清液采用PBS透析并维持4天，期间每隔6小时更换一次，收集透析后液体，保存于-20℃中，即为原料-载体复合物1。
实施例11
本实施例提供一种原料-载体复合物的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例10的区别在于，采用实施例4制备的原料2替代实施例1制备的原料1，其他步骤保持一致，最后获得原料-载体复合物2。
实施例12
本实施例提供一种原料-载体复合物的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例10的区别在于，采用实施例7制备的原料3替代实施例1制备的原料1，其他步骤保持一致，最后获得原料-载体复合物3。
实施例13
本实施例提供一种联苯吡菌胺抗体的制备方法，具体步骤如下：
称量300μg实施例10制备的原料-载体复合物1，以PBS缓冲液：弗式完全佐剂试剂＝1：1的注射量对2千克的实验兔进行皮下注射，共注射四次，每次间隔21天，除第一次注射外，其他三次注射搭配用弗式不完全佐剂，第四次注射结束后十天取实验兔全血，在4℃凝固过夜，两次离心分离血清，用1体积饱和硫酸铵溶液沉淀2次抗体，沉淀保存在4℃，用含有1％(w/v)OVA的PBS稀释四倍，保存在4℃，即为抗体1；
实施例14
本实施例提供一种联苯吡菌胺抗体的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例13的区别在于，采用实施例11制备的原料-载体复合物2替代实施例10制备的原料-载体复合物1，最后获得抗体2，实验兔相关信息与实施例13相同。
实施例15
本实施例提供一种联苯吡菌胺抗体的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例13的区别在于，采用实施例12制备的原料-载体复合物3替代实施例10制备的原料-载体复合物1，最后获得抗体3，实验兔相关信息与实施例13相同。
实施例16
本实施例提供一种免疫检测试剂条的制备方法，具体步骤如下：
将三个浓度的实施例1制备的原料1和羊抗兔IgG抗体分别均匀喷洒在NC膜上，三个浓度的实施例1制备的原料1分别为0.08μg/mL、0.8μg/mL、8μg/mL，即为T1、T2、T3线(检测线)，羊抗兔IgG抗体为C线(质控线)；样品垫用含有1％BSA和0.5％Tween20的PBS预处理，样品垫具体为无纺布材质，吸收垫为吸水滤纸，将样品垫与吸收垫分别与NC膜的两端重叠粘贴，在50℃下干燥3小时后，即获得简易的免疫检测试剂条，免疫检测试剂条长10厘米宽1厘米，检测线和质控线长0.8厘米，宽度与免疫检测试剂条保持一致，且三条检测线和一条质控线均匀间隔。
实施例17
本实施例提供一种免疫检测试剂条的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例16的区别在于，采用实施例4制备的原料2，替代实施例1制备的原料1，其他步骤与实施例16保持一致。
实施例18
本实施例提供一种免疫检测试剂条的制备方法，具体步骤如下：
本实施例与实施例16的区别在于，采用实施例7制备的原料3，替代实施例1制备的原料1，其他步骤与实施例16保持一致。
性能测试
1、联苯吡菌胺检测试剂关键原料纯度分析
采用高效液相色谱分析对实施例1-9制备的联苯吡菌胺检测试剂关键原料进行分析，获得实施例1-9制备的联苯吡菌胺检测试剂关键原料的纯度，如表1所示：
表1联苯吡菌胺检测试剂关键原料纯度分析
由表1可知，联苯吡菌胺检测试剂关键原料纯度均较高，最低93％，最高达到了95.7％。
2、核磁共振氢谱分析
根据检测需求，将实施例1、实施例4、实施例7制备的联苯吡菌胺检测试剂关键原料进行核磁共振氢谱分析，采用四氯甲烷进行溶解，在样品管中达到4cm高度，然后开机启动仪器，获得核磁共振氢谱图。
图谱如图3所示，其中(a)为原料1的核磁共振氢谱图，(b)为原料2的核磁共振氢谱图，(c)为原料3的核磁共振氢谱图，图上可见结构氢的具体位置分布，与原料1、原料2、原料3的结构对应良好。
3、食品场景下联苯吡菌胺检测
采用三种食品进行检测，分别为燕麦、菜籽油、羊肚，具体处理方式如下：
燕麦的处理方式：称量2g燕麦，碾碎成粉末状置于50mL离心管中，加入10mL乙腈，在200rpm的摇床上混匀8min，加入100μL1M的氢氧化钠溶液，继续在摇床上混匀8min，以3200g、4℃离心20分钟，将上清液在60℃氮气流下进行干燥，PBS缓冲液进行溶解，配置成总体积为1mL的液体，用于检测；
菜籽油的处理方式：称量2g菜籽油置于50mL离心管中，加入10mL乙腈，在200rpm的摇床上混匀8min，加入100μL1M的氢氧化钠溶液，继续在摇床上混匀8min，采用滤纸进行过滤，滤液在60℃氮气流下进行干燥，PBS缓冲液进行溶解，配置成总体积为1mL的液体，用于检测；
羊肚的处理方式：称量2g羊肚，剪碎，加入1.5mLPBS缓冲液置于5mL破碎器研磨管中，加入5颗直径4mm的不锈钢研磨珠，以40HZ均质速度处理10分钟，取出，纱布过滤，滤液置于50mL离心管中，加入10mL乙腈，在200rpm的摇床上混匀8min，加入100μL1M的氢氧化钠溶液，继续在摇床上混匀8min，以4000g、4℃离心15分钟，将上清液在60℃氮气流下进行干燥，PBS缓冲液进行溶解，配置成总体积为1mL的液体，用于检测；
以燕麦为例，将实施例13的抗体，与CdSe/ZnS量子点按照质量比10：1混合后在37℃下孵育30分钟，然后在10000g离心力下离心10分钟，弃去上清，沉淀采用1MTris-HCl重悬，按照1：1的体积比量取燕麦处理后的液体与重悬液，混合均匀后全部滴入实施例16制备的免疫检测试剂条的样品垫，静置3分钟后进行检测。实施例14的抗体对应实施例17制备的免疫检测试剂条，实施例15的抗体对应实施例18制备的免疫检测试剂条。
菜籽油、羊肚的检测过程与燕麦保持一致，三种食品中联苯吡菌胺检测结果如下：
表2食品中联苯吡菌胺检测结果(单位：μg/mL)
注：“-”表示未检出
由表2可知，燕麦、菜籽油、羊肚中联苯吡菌胺含量均较低，在食品安全规范限值之内。不同的联苯吡菌胺检测试剂关键原料对同一食品表现出了较好的一致性，证明本发明制备的原料1、原料2、原料3可以作为包被原进行使用，在不同的食品中都能发挥较为精准的检测效果。实施例16-18制备的免疫检测试剂条，设置了三个不同的检测线，在没有荧光检测仪的场景下，可以采用便携式荧光检测仪，通过照射判断所测样品是否超出食品安全规范限值，效率较高，可快速进行判断。
4、交叉验证
选择啶酰菌胺(CAS：188425-85-6)、吡噻菌胺(CAS：183675-82-3)、氟唑菌酰胺(CAS：907204-31-3)进行检测，以啶酰菌胺为例，购买其标准品，并配置成0.08μg/mL、0.8μg/mL、8μg/mL三个浓度的溶液，任一浓度下的溶液相当于实验测试三中燕麦处理后的液体，与相应含有抗体和量子点的重悬液按照1：1进行混合，然后采用对应的免疫检测试剂条进行检测，其他两种物质与啶酰菌胺保持一致。
在荧光检测仪的照射下，任一免疫检测试剂条全部发光，并与C线保持一致，效果类似于实验测试三中菜籽油的检测结果，已确定啶酰菌胺、吡噻菌胺、氟唑菌酰胺存在，但免疫试剂条并未有检测联苯吡菌胺时的效果，可知这三种物质并不能与抗体进行良好结合，因此全部抗体均与免疫检测试剂条上的包被原结合，即实施例13、实施例14、实施例15制备的抗体，仅可以与联苯吡菌胺检测试剂关键原料、联苯吡菌胺特异性结合，而与其他和联苯吡菌胺具有相似结构，且作用原理一致的杀菌剂不发生免疫反应。这种性能能更加精准辅助各种场合下联苯吡菌胺的检测，而不必考虑其他杀菌剂是否存在。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。