技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一种盐酸贝凡洛尔的组合物及其异构体杂质的检测方法。
背景技术
盐酸贝凡洛尔(Bevantolol hydrochloride)是一种脂溶型选择性β1受体阻断剂，可阻断β受体减慢心率，降低心肌收缩力和血压，无内在拟交感活性。该药具有弱膜稳定作用，并能扩张血管，用于治疗高血压和心绞痛。
盐酸贝凡洛尔化学名为：1-[[2-(3,4-二甲氧苯基)乙基]氨基]-3-(3-甲基苯氧基)-2-丙醇盐酸盐，结构如下所示：
陆涛、唐伟方等在中国医药工业杂志(第25卷，第1期，1994年)中报道了盐酸贝凡洛尔的合成工艺，以间甲苯酚为起始物料，经醚化，胺解，成盐，制得盐酸贝凡洛尔。间甲苯酚是从混合甲酚中分离所得，由于混合甲酚中包含邻甲苯酚、间甲苯酚和对甲苯酚，其中对甲苯酚和间甲苯酚沸点非常接近，很难通过常规的精馏方法分开。因此，间甲苯酚中不可避免会含有少量的邻甲苯酚和对甲苯酚。该两种杂质会参与反应，传递到盐酸贝凡洛尔中，形成邻位异构体杂质和对位异构体杂质。其结构如下所示：
盐酸贝凡洛尔中的异构体杂质会严重影响药品的纯度和质量，是决定药品是否合格的关键因素之一。因此，实现对盐酸贝凡洛尔中异构体杂质的有效分离检测对于控制产品质量具有重要意义。
中国专利申请CN104678013A报道了一种盐酸贝凡洛尔异构体杂质的分析检测方法，采用反相液相色谱法，其色谱条件如下：色谱柱：五氟苯基柱；流动相组成：A(水相)：B(甲醇)；流动相比例：A:B＝55：45-45：55；流动相流速：0.5-1.5ml/min；检测波长：210-280nm；柱温：20-40℃；检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。该方法可快速准确的检测出盐酸贝凡洛尔的异构体杂质含量。然而，由于该专利申请中尝试使用的Kromasil C18柱(4.6×250mm,5μm)等常规的色谱柱无法实现贝凡洛尔与邻位异构体及对位异构体很好的分离效果。因此，其使用了价格昂贵且使用寿命短的五氟苯基柱，这增加了盐酸贝凡洛尔异构体杂质检测的成本。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种盐酸贝凡洛尔的组合物及其异构体杂质的检测方法，目的在于：对盐酸贝凡洛尔中的异构体杂质含量进行检测，实现在高效液相色谱检测盐酸贝凡洛尔异构体杂质的方法中，用成本较低的C18柱替代高成本的五氟苯基柱。
一种盐酸贝凡洛尔的组合物，其邻位异构体杂质含量不高于0.5％，对位异构体杂质含量不高于0.5％，且邻位异构体杂质或对位异构体杂质的含量不同时为0；
所述邻位异构体杂质结构为：
所述对位异构体杂质结构为：
优选的，其邻位异构体杂质含量不高于0.1％，对位异构体杂质含量不高于0.1％。
优选的，它的HPCL色谱如图1至图6任一幅所示；
色谱条件为：色谱柱采用Inertsil ODS-3，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为环糊精和/或其衍生物的水溶液，流动相B为甲醇。
本发明还提供一种药物组合物，它由上述组合物与药物上可接受的辅料或辅助性成分组成。
本发明还提供用于检测上述组合物中异构体杂质的检测方法，包括如下步骤：取所述组合物，采用高效液相色谱法检测；
其中，色谱条件为：色谱柱采用Inertsil ODS-3，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为环糊精和/或其衍生物的水溶液，流动相B为甲醇。
优选的，所述环糊精和/或其衍生物与水的质量体积比为10～30:1mg/ml。
优选的，所述环糊精为β-环糊精；所述环糊精衍生物选自羟丙基-β-环糊精、磺化-β-环糊精或羧甲基-β-环糊精中的至少一种。
优选的，所述流动相A用磷酸调pH至2.0～4.0，优选为3.0；
和/或，所述流动相A中包含缓冲剂，所述缓冲剂选自磷酸盐，所述磷酸盐的浓度为30～100mM，优选50mM；
和/或，所述流动相A中包含三乙胺，所述三乙胺与水的体积比为1～3:100ml/ml，优选2:100ml/ml。
优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种，优选为磷酸二氢铵。
优选的，所述色谱条件还包括：所述流动相A与流动相B的体积比为58～65:35～45；和/或，检测波长为210～240nm；和/或，流速为0.8～1.2ml/min；和/或，柱温为20～40℃；和/或，进样量为10～20μl。
本发明提出对盐酸贝凡洛尔中的异构体杂质含量进行检测，进而控制盐酸贝凡洛尔药物的质量。在本发明的色谱检测中，采用的Inertsil ODS-3是一种C18柱，即以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。C18柱是因其价格便宜，反相系统简单，重复性好，柱子能长期稳定工作，因而在分析工作中应用最为广泛。为了解决C18柱无法分离盐酸贝凡洛尔及其异构体杂质的问题，本发明对流动相的组成等色谱条件进行优化，实现了利用InertsilODS-3分离盐酸贝凡洛尔及其异构体杂质的的目的。本发明专属性强、灵敏度高、重复性好、准确度好，且避免使用价格昂贵且使用寿命短的五氟苯基柱，有效降低了盐酸贝凡洛尔的异构体杂质的检测成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实施例1中供试品的高效液相色谱图；
图2实施例2中供试品的高效液相色谱图；
图3实施例3中供试品的高效液相色谱图；
图4实施例4中供试品的高效液相色谱图；
图5实施例5中供试品的高效液相色谱图；
图6实施例6中供试品的高效液相色谱图；
图7对比例1中供试品的高效液相色谱图；
图8对比例2中供试品的高效液相色谱图；
图9对比例3中供试品的高效液相色谱图；
图10对比例4中供试品的高效液相色谱图；
图11对比例5中供试品的高效液相色谱图；
图12对比例6中供试品的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例和对比例中所用的试剂和材料均为市售。
本发明中判断分离度的依据如下：《中华人民共和国药典》(以下简称中国药典)2020版四部通则0512《高效液相色谱法》中规定，分离度用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于1.5。
实施例1
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.6％β-环糊精+50mM磷酸二氢铵，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝58:42。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图1，供试品的实验数据见表1。
表1
由图1和表1可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
实施例2
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.6％β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝60:40。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图2，供试品的实验数据见表2。
表2
由图2和表2可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
实施例3
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.6％β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝65:35。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图3，供试品的实验数据见表3。
表3
由图3和表3可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
实施例4
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(3.0％羟丙基β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝64:36。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图4，供试品的实验数据见表4。
表4
由图4和表4可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
实施例5
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1％β-环糊精+1％羟丙基β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝60:40。
进样量：20μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图5，供试品的实验数据见表5。
表5
由图5和表5可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
实施例6
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1％β-环糊精+1％羟丙基β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝61:39。
进样量：10μl。
检测波长：230nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
稀释剂：乙腈-水(20:80，v/v)
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各1μg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图6，供试品的实验数据见表6。
表6
由图6和表6可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质和邻位异构体杂质分离度符合中国药典要求。
对比例1
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Sepax GP-Phenyl，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(0.8％β-环糊精+2％三乙胺,磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝53:47。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及邻位、对位异构体杂质适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图7，供试品的实验数据见表7。
表7
由图7和表7可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔、邻位异构体杂至和对位异构体杂质的色谱峰完全重合，且拖尾严重，无法分离。
对比例2
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Hypersil silica，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.6％β-环糊精+50mM磷酸二氢铵，磷酸调pH至6.5)：流动相B(甲醇)＝52:48。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图8，供试品的实验数据见表8。
表8
由图8和表8可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔、邻位异构体杂质和对位异构体杂质的色谱峰完全重合，无法分离。
对比例3
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.6％β-环糊精+50mM磷酸二氢铵，磷酸调pH至6.5)：流动相B(甲醇)＝55:45。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图9，供试品的实验数据见表9。
表9
由图9和表9可见，在该色谱条件下，对位异构体杂质、盐酸贝凡洛尔和邻位异构体杂质依次出峰，其中盐酸贝凡洛尔与邻位异构体杂质分离度为3.1，符合中国药典要求；盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质分离度为1.1，不符合中国药典要求。
对比例4
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1.4％β-环糊精+150mM乙酸铵，乙酸调pH至4.0)：流动相B(甲醇)＝60:40。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图10，供试品的实验数据见表10。
表10
由图10和表10可见，在该色谱条件下，基线噪音较大，盐酸贝凡洛尔、邻位异构体杂质和对位异构体杂质的色谱峰完全重合，无法分离。
对比例5
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(0.5％磺丁基β-环糊精钠盐+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝60:40。
进样量：10μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1ml含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图11，供试品的实验数据见表11。
表11
由图11和表11可见，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质分离度为1.4，不符合中国药典要求；盐酸贝凡洛尔与邻位异构体杂质分离度为2.3，符合中国药典要求。
对比例6
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(0.8％β-环糊精+0.8％羟丙基β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝60:40。
进样量：20μl。
检测波长：220nm。
流速：1.0ml/min。
柱温：35℃。
溶液配制及测定法：
取盐酸贝凡洛尔及其异构体适量，用20％乙腈溶解并稀释制成每1mL含有盐酸贝凡洛尔1mg和邻位、对位异构体杂质各0.1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。按上述条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图12，供试品的实验数据见表12。
表12
由图12和表12可见，在该色谱条件下，盐酸贝凡洛尔与对位异构体杂质分离度为1.2，不符合中国药典要求；盐酸贝凡洛尔与邻位异构体杂质分离度为2.3，符合中国药典要求。
从上述实施例和实验例可以看出，采用Inertsil ODS-3色谱柱时，在优选的流动相等色谱条件下，能够实现对盐酸贝凡洛尔与异构体杂质的有效分离。
下面对实施例6中的色谱条件进行方法学验证，以进一步证明本发明的技术效果。
实验例1方法学验证
色谱条件：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪。
色谱柱：Inertsil ODS-3，4.6mm×250mm×5μm。
流动相：流动相A(1％β-环糊精+1％羟丙基β-环糊精+2％三乙胺，磷酸调pH至3.0)：流动相B(甲醇)＝61:39。
进样量：10μL。
检测波长：230nm。
流速：1.0mL/min。
柱温：35℃。
稀释剂：乙腈-水(20:80，v/v)
溶液配制：
空白：稀释剂。
对照品储备溶液：称取盐酸贝凡洛尔邻位异构体对照品和盐酸贝凡洛尔对位异构体对照品各约25mg，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(1mg/ml)。
对照品稀释溶液：精密移取对照品储备溶液2ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(100μg/ml)。
对照品溶液(STD)：精密移取对照品稀释溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(1μg/ml)。
质控对照品储备溶液：称取盐酸贝凡洛尔邻位异构体和盐酸贝凡洛尔对位异构体各约25mg，置同一25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(1mg/ml)。
质控对照品稀释溶液：精密移取质控对照品储备溶液2ml，置20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(100μg/ml)。
质控对照品溶液(CHK)：精密移取对照品稀释溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得(1μg/ml)。
加样溶液：称取盐酸贝凡洛尔对照品约25mg，置25ml量瓶中，用对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：称取盐酸贝凡洛尔样品约25mg，置25ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(1mg/ml；一式两份)。
1、系统适用性
取加样溶液、STD和CHK溶液，按上述色谱条件，注入色谱系统，记录色谱图，系统适用性溶液中邻位异构体和对位异构体与相邻峰最小分离度应大于1.5；对照品溶液中邻位异构体和对位异构体峰信噪比应不小于20(以第一针计)，连续6针STD溶液邻位异构体和对位异构体的峰面积相对标准偏差(RSD)应小于10.0％，CHK溶液中邻位异构体和对位异构体回收率应在90％～110％之间。
测定结果见表13。
表13系统适用性测定结果
由表13结果可知，系统适用性测定中，对位异构体和邻位异构体与相邻峰最小分离度为1.9；对照品溶液中对位异构体峰信噪比为50.5，邻位异构体峰信噪比为35.5；连续6针STD溶液对位异构体的峰面积RSD为2.6％，邻位异构体的峰面积RSD为5.8％；CHK溶液中邻位异构体回收率为108.3％，对位异构体回收率为96.2％，均符合要求。
2、耐用性
1)溶液稳定性
考察对照品溶液和加样溶液随时间的变化规律，在室温条件下，分别于一定时间内进样测定，考察其溶液稳定性，要求不同时间对照品溶液中位置异构体峰面积的RSD不大于10.0％；加样溶液中位置异构体的峰面积，与初始峰面积相比，若相对误差不超过±10.0％，则样品溶液不用临用新制，反之则样品溶液需临用新制。
结果：对照品溶液放置83h后，邻位异构体峰面积的RSD为5.2％，对位异构体峰面积的RSD为3.1％；加样溶液放置83h后，邻位异构体峰面积的相对误差为-1.83％，对位异构体峰面积的相对误差为-3.83％，表明对照溶液与加样溶液在室温下放置83h内均稳定。
2)色谱条件改变
通过改变流速±0.1ml/min、柱温±2℃、波长±2nm来评估色谱条件的承受程度。要求各个变动的色谱参数条件下，加样溶液的杂质含量与正常条件下比较，相对误差不得过±20％。
结果：
色谱条件发生微小变动(流速±0.1ml/min、柱温±2℃、波长±2nm)时，加样溶液中邻位异构体含量的相对误差最大为-18.6％，对位异构体含量的相对误差最大为-7.3％，均符合要求。
3、线性及范围
称取盐酸贝凡洛尔邻位异构体对照品和盐酸贝凡洛尔对位异构体对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成一系列浓度的线性测试溶液，以测得的响应信号Y对被测物的浓度X作图，再用最小二乘法进行线性回归，其相关系数(r)的数值应不小于0.995。
结果：对位异构体线性方程为y＝18.9780x-0.4227，相关系数r为0.9998，符合要求。邻位异构体线性方程为y＝15.4006x-0.1970相关系数r为0.9971，符合要求。
4、准确度
准确度是通过配制定量限(LOQ)、100％、120％三个不同浓度的准确度溶液测得的回收率所得。通过测定不同浓度邻位异构体和对位异构体测定结果和理论值之间的回收率而实现的，要求邻位异构体和对位异构体在LOQ浓度水平中回收率应在70％～130％范围内，在其余浓度水平中回收率应在80％～120％范围内，以证实方法具有良好的准确度。
结果：邻位异构体和对位异构体在LOQ浓度水平中回收率分别为94.9％、97.2％；邻位异构体和对位异构体在100％浓度水平中回收率分别为100.6％、99.0％；邻位异构体和对位异构体在120％浓度水平中回收率分别为96.1％、95.4％，均符合要求。
5、重复性
重复性是通过配制6份样品加标溶液测得的回收率所得，要求6份样品加标溶液中邻位异构体和对位异构体回收率的RSD均应不大于10.0％，来证实方法具有良好的精密度。
结果：邻位异构体和对位异构体回收率的RSD(n＝6)分别为3.9％、3.6％，符合要求。
从上述实施例和实验例可知，本发明的检测方法利用高效液相色谱法，能够以低成本的C18柱作为色谱柱实现对盐酸贝凡洛尔及其异构体杂质的分离。且通过对本发明检测方法的系统适用性、准确度、重复性、线性及范围以及耐用性等项目的验证，结果表明各项均符合要求，本发明提供的上述检测方法可用于盐酸贝凡洛尔中邻位异构体和对位异构体的测定，从而有效控制盐酸贝凡洛尔及其制剂的质量，有利于保证用药的安全性和有效性。