技术领域
本发明涉及天然药物领域。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球最常见的健康问题之一，其主要特征是在没有大量饮酒的情况下出现脂质蓄积。临床上NAFLD在组织学上可分为非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFLD与2型糖尿病、肥胖、脂代谢紊乱、动脉粥样硬化、高血压等代谢紊乱密切相关。NAFLD的发病机制尚不清楚，“二次打击”假说(最近更新为“多次打击”)一直是主流理论。“第一次打击”是三酰甘油(TG)和游离脂肪酸的过度积累，而“二次打击”是指“第一次打击”后的炎症、氧化应激和细胞凋亡。
肝脏、饮食、脂肪从头生成和从脂肪和其他组织释放的脂肪酸是游离脂肪酸的三种主要来源。禁食期间脂肪的从头生成占肝脏脂肪酸库的30％。游离脂肪酸向肝细胞的外流增强导致脂肪毒性、脂质代谢紊乱和脂质过度积累，从而促进NAFLD的发病。肝脏脂质代谢可能是受脂肪生成相关蛋白如SREBP1、FAS和SCD-1的调节。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)在调节脂质合成、储存、脂肪酸氧化和脂肪生成中发挥着关键作用。C/EBPβ诱导PPARγ和C/EBPα的表达，形成一个正反馈回路，有助于诱导和维持脂肪细胞特异性基因的表达。积累的脂肪主要以TG的形式储存在脂肪组织的脂滴中。
Procyanidin C1和procyanidin C2是原花青素类B型三聚体。本发明拟研究上述两种原花青素三聚体是否有抑制脂质积累、抗非酒精性脂肪肝的活性。
发明内容
本发明研究发现，Procyanidin C1和procyanidin C2对抑制油酸(OA)诱导的HepG2细胞脂质积累和氧化应激的影响。
两种原花青素的结构式如下：
基于此，本发明提供了原花青素Procyanidin C1或\和procyanidin C2在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。
进一步地，所述药物是抑制脂质积累的药物。
更进一步地，所述药物是抑制肝脏脂质积累的药物。
更进一步地，所述脂质选自TG或/和TC。
TG：甘油三酯,TC：总胆固醇。
进一步地，所述药物是抗氧化的药物。
更进一步地，所述药物是增加SOD含量、降低MDA含量的药物。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员。
MDA，丙二醛，是衡量氧化胁迫程度的常用指标之一。
脂滴是由中性脂质核心,单层磷脂膜和表面蛋白构成的球形细胞器.细胞氧化应激导致脂滴数量增多,而脂滴增多会缓解细胞氧化应激,但是脂滴调控细胞氧化应激的分子机制尚不明确.细胞氧化应激的原因主要是线粒体的氧化损伤,其会导致线粒体释放更多的活性氧,从而引起线粒体损伤,内质网应激等,引发细胞凋亡.有研究表明脂滴与线粒体可以相互接触,猜测脂滴与线粒体间的互作会调控线粒体的损伤,进而调节细胞氧化应激。
更进一步地，所述药物是改善线粒体功能的药物。
更进一步地，所述药物是避免或修复线粒体损伤的药物。
进一步地，所述药物是通过AMPK/mTOR信号通路降低脂肪生成蛋白表达的药物。
AMPK是高度保守的新陈代谢调节因子，能在细胞和生理水平的代谢应激下维持能量平衡。细胞不断适应自身的新陈代谢以满足能量需求，并对营养物质的可用性做出反应。一般来说，AMPK通过感知AMP∶ATP和ADP∶ATP的比率变化而被激活，通过抑制消耗ATP的合成代谢过程，促进产生ATP的分解代谢过程，从而恢复能量平衡。此外，AMPK的活性被多个上游信号调节，从而使AMPK成为细胞利用的中心节点，以协调其代谢与特定能量需求。除此之外，AMPK的治疗潜力已被广泛认可，并且用于治疗代谢性疾病如糖尿病、肥胖、炎症和癌症等。mTOR是生长因子和营养信号的整合器，整合上游的多种信号进而调节细胞的生长。mTORC1的主要功能是调节蛋白质合成和细胞周期进程，而mTORC2可在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活方面发挥重要作用。
AMPK和mTORC1是关键的细胞营养指标和细胞生长调节因子。因此，该通路的失调与许多人类疾病有关。例如，通过TSC1/TSC2中的突变或PI3K通路的组成性活化而不受控制的mTORC1激活会导致肿瘤发生。因此，已经显示mTORC1抑制剂对TSC疾病具有治疗作用。此外，mTORC1抑制剂雷帕霉素类似物已被批准用作治疗晚期肾癌的药物，并且许多临床试验正在使用mTOR抑制剂进行癌症治疗。mTORC1还可以通过自噬调节蛋白质代谢，靶向合成和降解；因此，mTORC1的抑制可能有助于开发有关蛋白病的药物，包括神经退行性疾病如阿尔茨海默病。同样，AMPK激活的缺陷可能与肿瘤发生有关，因为上游激酶LKB1长期以来被认为是肿瘤抑制因子。据报道二甲双胍是最广泛使用的糖尿病药物，可以抑制癌症，因为使用二甲双胍的患者癌症的发生率显著降低。此外，AMPK和mTOR在能量代谢中的突出作用使其成为糖尿病和肥胖症等代谢性疾病的药物靶点。
更进一步地，所述药物是降低FAS、ACC、SCD-1、SREBP-1c的表达水平，上调PPARα、CTP1A蛋白表达水平的药物。
附图说明
图1.Procyanidin C1和procyanidin C2孵育后HepG2细胞活力的变化；(A)Procyanidin C1的化学结构；(B)Procyanidin C2的化学结构；(C)与Procyanidin C1孵育后的HepG2细胞活力。(D)与Procyanidin C2孵育后的HepG2细胞活力。(E)与orilistat孵育后的HepG2细胞活力；(g)通过将OA和Procyanidin C1，procyanidin C2和orilistat共孵育48小时，HepG2细胞活力没有变化。
图2.Procyanidin C1和procyanidin C2抑制OA诱导的HepG2细胞中的脂质积累。在0.5mM OA存在下，将HepG2细胞与Procyanidin C1和procyanidin C2共孵育48小时。(A)HepG2细胞中的油红O染色；(B)HepG2细胞内脂滴的Nile red染色；(C)HepG2细胞中细胞内TG含量的定量；(D)HepG2细胞中细胞内TC含量的定量。
图3.Procyanidin C1和procyanidin C2抑制OA诱导的HepG2细胞中氧化还原水平。(A)SOD含量；(B)MDA含量；(C)ROS水平；(D)线粒体源ROS水平。图4.Procyanidin C1和procyanidin C2改善线粒体功能。(A)SOD含量；(B)MDA含量；(C)ROS水平。
图5.Procyanidin C1和procyanidin C2对脂质合成蛋白的影响。(A)SREBP-1c,ACC，FAS，SCD-1，PPARγ蛋白的表达水平。(B)CPT1A，PPARα蛋白的表达水平。(C)Nrf2，HO-1蛋白的表达水平。(D)AMPK，mTOR，JNK蛋白的表达水平。图6.Procyanidin C1和procyanidinC2对高脂诱导的非酒精脂肪肝斑马鱼的影响。(A)生化指标TG,TC，LDL-C，HDL-C，GSH和SOD的水平；(B)斑马鱼的肝脏HE染色。
具体实施方式
实施例1
1.细胞活性研究
1.1.化学品和试剂
Procyanidin C1和procyanidin C2从上海源叶购买。OA、油红O和MTT购自SigmaAldrich。Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)购自Gibco。胎牛血清(FBS)来自浙江四季青。甘油三酯(TG)和超氧化物歧化酶(SOD)的测定试剂盒来自南京建成生物工程研究所(中国南京)。BCA检测试剂盒和蛋白裂解缓冲液购自Beyotime(中国上海)。抗体FAS、SCD-1、SREBP1、PPARγ、C/EBPα、Nrf2、HO-1和β-actin购买于Cell Signaling Technology。
1.2.HepG2细胞培养
HepG2是人肝癌细胞系，购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心(中国上海)。在37℃下，5％CO2，在补充有10％FBS的DMEM中培养细胞。
1.3.细胞活力测定
MTT法检测细胞活力，取对数生长期HepG2细胞调整浓度至1×105个/孔，每孔150μL接种于96孔板中培养24h。用含不同浓度的化合物溶液(Procyanidin C1，procyanidinC2)替换原有培养基，设置空白对照(Con)，继续培养48h后，MTT法检测490nm波长处的吸光值(A)。并按公式计算细胞存活率。细胞存活率/％＝A处理组/A空白组×100％。
1.4.油红O染色
油红O染色用于测量HepG2细胞中的脂滴含量。HepG2细胞在6孔板中以5×104细胞/mL的密度培养，培养基中加入0.5mM OA。10μM的Procyanidin C1，procyanidin C2处理细胞48小时。处理后，细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛在黑暗中固定30分钟。随后，将处理过的细胞用油红O溶液染色1小时。使用倒置光学显微镜观察、拍照脂滴。
1.5.TG含量的测量
试剂盒用于测定细胞内TG含量。在0.5mM OA存在下，HepG2细胞以每毫升5×104细胞的密度在6孔板中培养。在存在或不存在10μM的Procyanidin C1，procyanidin C2的情况下，将细胞孵育48h。经处理的细胞通过胰蛋白酶消化。消化离心的的细胞在冰上超声5分钟后破碎测定。
1.6.SOD水平的测量
试剂盒用于测定细胞内确定SOD的水平。在0.5mM OA存在下，HepG2细胞以每毫升5×104细胞的密度在6孔板中培养。10μM的Procyanidin C1，procyanidin C2将细胞孵育48小时。倒置显微镜下观察细胞形态。此外，根据制造商的协议，使用商业套件测量了SOD的水平。
1.7.蛋白质印迹分析
用冷PBS洗涤细胞并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆。将匀浆在4℃下以12,000g离心15分钟，并收集上清液。20μg蛋白质样品在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移至PVDF膜(Millipore.Billerica,MA,USA)。膜在室温下用脱脂牛奶溶液封闭1小时，然后在4℃下与一抗孵育过夜。TBST缓冲液洗膜2次，二抗孵育1h。β-actin用作内参对照。使用5200Multi Luminescent imaging systems(Tanon,Shanghai,China)使印迹可视化，使用ImageJ(NIH)分析条带强度。
1.8.斑马鱼非酒精性脂肪肝模型的建立及化合物处理
选择大小、体重相当的受精后20天的幼年斑马鱼，每组30条斑马鱼，模型组于高脂饲料喂养14天，喂食高脂饲料和高蛋白丰年虾，早晚各一次建模，14天后浸泡给药(Procyanidin C1，procyanidin C2，阳性药orilistat，每个化合物处理浓度是5μM)一周后，取幼鱼全组织组织测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、SOD及GSH水平。
1.9.统计分析
使用GraphPad Prism7.0(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA,USA)进行数据分析。结果表示为三个独立实验的平均标准偏差(SD)。使用未配对的t检验(两组)或单向方差分析(三组或更多组)进行组间比较。p<0.05被认为具有统计学意义。
2.结果
2.1化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对细胞活力的影响
MTT法初步用于测定化合物对HepG2细胞的细胞毒性。如图1所示，与对照组相比，化合物Procyanidin C1和procyanidin C2在浓度1～100μM之间对HepG2细胞活力没有细胞毒性作用。此外，阳性药奥利司他(orilistat)对细胞活力也没有影响。因此，化合物Procyanidin C1，procyanidin C2和orilistat的最佳处理浓度为10μM。
2.2化合物Procyanidin C1和procyanidin C2抑制OA处理的HepG2细胞中的脂质积累
为了研究Procyanidin C1和procyanidin C2是否影响细胞内脂质积累，进行了油红O染色。与对照组相比，0.5mM OA导致HepG2细胞中脂滴积累显着增加(图2A，2B)。与模型组相比，与Procyanidin C1和procyanidin C2孵育48小时后，细胞内脂滴明显减少。此外与模型组相比，Procyanidin C1和procyanidin C2处理后TG和TC含量显著降低(图2C，2D)。
2.3化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对氧化还原水平的影响
在氧化应激条件下，细胞通过激活其抗氧化防御机制来应对细胞损伤。我们通过分析SOD和MDA水平及活性氧的变化来研究化合物Procyanidin C1和procyanidin C2氧化应激的影响。如图3A，3B，与模型组相比，化合物Procyanidin C1和procyanidin C2处理后能增加HepG2细胞中SOD含量及降低MDA含量。此外，化合物Procyanidin C1和procyanidinC2也能降低总活性氧及线粒体源活性氧水平(图3C，3D)。
2.4化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对线粒体功能的影响
为了评价化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对线粒体功能的影响，我们进行了线粒体膜电势，线粒体质量数及电镜观察线粒体结构。如图4，与模型组相比，Procyanidin C1和procyanidin C2能提高HepG2细胞的膜电势(图4A)，同时也能提高线粒体质量数(图4B)。此外，Procyanidin C1和procyanidin C2处理后线粒体的结构也得到明显的改善，即线粒体数量增多，线粒体脊增加(图4C)。该结果表明，Procyanidin C1和procyanidin C2明显改善线粒体功能从而改善脂质积累。
2.5.化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对脂质合成蛋白的影响
为了确定化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对脂质积累的抑制作用的潜在机制，通过蛋白质印迹分析脂肪生成，脂肪酸氧化及相关信号通路的蛋白的表达水平。如图5，与模型组相比，Procyanidin C1和procyanidin C2能显著降低HepG2细胞中FAS，ACC，SCD-1，SREBP-1c的表达水平。同时上调与脂肪酸氧化相关的PPARα和CTP1A蛋白的表达水平。此外，Procyanidin C1和procyanidin C2也能显著增加抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的表达水平。最后Procyanidin C1和procyanidin C2也能显著上调磷酸化的AMPK和下调磷酸化的mTOR的表达水平。这些结果表明，Procyanidin C1和procyanidin C2通过AMPK/mTOR信号通路降低脂肪生成蛋白的表达来减少OA处理的HepG2细胞中的脂质积累，从而改善非酒精脂肪肝。
2.6.化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对高脂诱导的非酒精脂肪肝斑马鱼的影响
为了确定化合物Procyanidin C1和procyanidin C2对高脂诱导的非酒精脂肪肝斑马鱼的影响，我们通过生化指标和HE染色来评价化合物Procyanidin C1和procyanidinC2改善非酒精性脂肪肝。如图6，与模型组相比，Procyanidin C1和procyanidin C2能显著降低斑马鱼中TG和TC的含量，同时也能显著增加HDL-C，GSH和SOD的水平(图6A)。此外，HE染色结果表明Procyanidin C1和procyanidin C2能减少斑马鱼肝脏中脂质积累(图6B)。
3.结论
综上实验结果，发现原花青素类化合物Procyanidin C1和procyanidin C2具有降低脂质积累和提高氧化还原水平，进而具有抗非酒精性脂肪肝的作用。