技术领域
本发明涉及药物化学合成技术领域，具体涉及一种伊特卡肽关键中间体的合成方法。
背景技术
原发性甲状旁腺功能亢进症(PHPT)是一种相对常见的内分泌疾病，是由于甲状旁腺本身病变引起的甲状旁腺激素(PTH)的合成与分泌过多所引起的疾病。伊特卡肽是由Amgen Europe B.V开发的一种拟钙剂，具有调节甲状旁腺主细胞表面钙敏感受体(CaSR)分泌甲状旁腺的作用，从而降低PTH水平，可用于治疗甲状旁腺功能亢进。伊特卡肽也适用于慢性肾脏病(CKD)接受血液透析的成人患者的继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)，可在进行血液透析的同时通过静脉给药，这对于每天都需要使用大量药物的慢性肾病患者来说是一个福音。
二硫键的形成是伊特卡肽合成工艺的关键步骤。目前，伊特卡肽的合成方法主要包括液相合成法和固相合成法。
专利CN105504012A以Rink氨基树脂为固相载体，采用传统固相合成法逐步偶联得到线性肽树脂，然后在固相上通过空气氧化形成二硫键，随后经裂解、纯化、转盐得到目标产物。但该方法是以固相的方式形成二硫键，反应时间过长，一般需要24h以上，不利于大规模生产。
专利CN 111925418A通过采用Cbz保护的氨基酸进行液相偶联，易于控制纯度，有效地避免了缺失肽；并通过采用二硫二吡啶与半胱氨酸形成的二硫键的活性中间体Boc-L-Cys(S-S-Py)-OtBu与肽链连接，便于对二硫键的合成进行精准控制。但该方法中裸露巯基的7肽中间体需要HPLC纯化制备，全过程需要两次HPLC纯化制备，增加了成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种伊特卡肽关键中间体的合成方法，该合成方法以Fmoc-Cys(Bzl)-OH为起始原料，通过酯化、还原以及氧化反应制备得到二硫键化合物以作为中间体用于伊特卡肽的合成。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
一种伊特卡肽关键中间体的合成方法，以Fmoc-Cys(Bzl)-OH为起始原料，Fmoc-Cys(Bzl)-OH与叔丁醇发生酯化反应得到化合物A1，化合物A1通过还原反应得到化合物A2，化合物A2与N-乙酰基-D-半胱氨酸发生氧化反应得到化合物A3。
合成路线如下：
进一步地，所述酯化反应在脱水剂和催化剂的存在下进行。更进一步地，所述脱水剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中的一种或几种；所述催化剂包括但不限于4-二甲氨基吡啶(DMAP)、咪唑、1,2,4-三氮唑(TMAJ)中的一种或几种。脱水剂的作用是去除酯化反应过程中生成的水分，促进酸与醇反应生成酯。催化剂的作用是促进酯化反应的进行，提高反应速率，降低反应的活化能。
进一步地，所述Fmoc-Cys(Bzl)-OH、叔丁醇、脱水剂和催化剂的摩尔比为1:(1～4):(0.5～2):(0.1～1)。酯化反应可以在室温下进行，也可以通过加热来提高反应速率，但需控制加热温度，防止副产物的生成。
关于酯化反应的反应溶剂，可以选择对Fmoc-Cys(Bzl)-OH溶解性好同时能与叔丁醇互溶且不会与Fmoc-Cys(Bzl)-OH、叔丁醇、脱水剂、催化剂发生反应的有机溶剂，如二氯甲烷，沸点低，利于回收再利用。
进一步地，所述还原反应在氢气氛围下进行。化合物A1在氢气氛围下进行还原反应，还原硫醚生成巯基。
进一步地，所述还原反应以钯碳、氢氧化钯中的至少一种作为催化剂。在一些具体的实施方式中，所述催化剂用量为化合物A1质量的0.01～1倍。
关于还原反应的反应溶剂，可以选择对化合物A1溶解性好且不会与化合物A1发生反应的有机溶剂，如乙醇，沸点低，利于回收再利用；并且毒性小，使用安全性高。
进一步地，所述氧化反应在氧化剂的存在下进行。在一些具体的实施方式中，所述氧化剂为碘、氧气或空气。化合物A2的巯基与N-乙酰基-D-半胱氨酸的巯基通过氧化形成二硫键。
进一步地，所述化合物A2与N-乙酰基-D-半胱氨酸的摩尔比为1:(1～2)。当氧化剂为碘时，所述化合物A2与碘的摩尔比为1:(1～2)。
本发明的有益效果是：本发明以Fmoc-Cys(Bzl)-OH为起始原料，依次通过与叔丁醇的酯化反应、硫醚的还原反应以及与N-乙酰基-D-半胱氨酸的氧化反应合成得到伊特卡肽关键中间体，该合成方法不仅大大简化了合成操作，还能获得高纯度、高收率的伊特卡肽关键中间体。
附图说明
图1为化合物A3的质谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和图示，进一步阐述本发明。
实施例1
化合物A1的合成：
在0℃下向Fmoc-Cys(Bzl)-OH(11.97g，27.6mmol)、叔丁醇(6.14g，82.8mmol)和DMAP(2.70g，22.1mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中分三次加入DCC(8.54g，41.4mmol)，在0℃下搅拌15min，然后加热至25℃搅拌反应24h。停止反应，反应液通过硅藻土过滤，并用二氯甲烷洗涤，滤液减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A1。纯度为98％，收率为92％。
化合物A2的合成：
向加氢釜中加入10g化合物A1、0.5g 5％钯碳和50mL乙醇，关闭加氢釜，用氮气置换3次，充入1.0MPa氢气，室温反应12h。停止反应，反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸馏，残余物用正庚烷打浆，得到化合物A2。纯度为99％，收率为85％。
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(2.04g，12.5mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，逐滴滴加碘(10g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应40min。停止反应，将反应液加入100mL乙酸乙酯中，再依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为95％，收率为50％。
实施例2
化合物A1的合成：
在0℃下向Fmoc-Cys(Bzl)-OH(11.97g，27.6mmol)、叔丁醇(2.05g，27.6mmol)和DMAP(3.37g，27.6mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中分三次加入DCC(11.39g，55.2mmol)，在0℃下搅拌15min，然后加热至30℃搅拌反应24h。停止反应，反应液通过硅藻土过滤，并用二氯甲烷洗涤，滤液减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A1。纯度为97％，收率为90％。
化合物A2的合成：
向加氢釜中加入10g化合物A1、0.1g氢氧化钯和50mL乙醇，关闭加氢釜，用氮气置换3次，充入1.2MPa氢气，室温反应18h。停止反应，反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸馏，残余物用正庚烷打浆，得到化合物A2。纯度为99％，收率为81％。
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(4.08g，25mol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，逐滴滴加碘(15g/L，25mmol)的乙醇溶液，滴加完毕后反应30min。停止反应，将反应液加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为93％，收率为55％。
实施例3
化合物A1的合成：
在0℃下向Fmoc-Cys(Bzl)-OH(11.97g，27.6mmol)、叔丁醇(8.18g，110.4mmol)和DMAP(0.34g，2.76mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中分三次加入DCC(2.85g，13.8mmol)，在0℃下搅拌15min，然后加热至回流状态搅拌反应12h。停止反应，反应液通过硅藻土过滤，并用二氯甲烷洗涤，滤液减压浓缩，残余物用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A1。纯度为98％，收率为87％。
化合物A2的合成：
向加氢釜中加入10g化合物A1、1g 5％钯碳和50mL乙醇，关闭加氢釜，用氮气置换3次，充入1.0MPa氢气，室温反应12h。停止反应，反应液用硅藻土过滤，滤液减压蒸馏，残余物用正庚烷打浆，得到化合物A2。纯度为99％，收率为89％。
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(3.06g，18.75mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，逐滴滴加碘(12g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应15min。停止反应，将反应液加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为90％，收率为46％。
根据实施例1～3可以看出，由化合物A2合成化合物A3的收率很低，从而导致化合物A3的生成量少。为了提高化合物A3的收率，发明人进一步研究了该氧化反应的反应条件，在以碘作为氧化剂的前提下，筛选可以实质性提高反应活性的催化剂，提高化合物A2和N-乙酰基-D-半胱氨酸的转化率，促进二硫键的生成。最终发明人从几十种不同类型的催化剂中筛选出氧钛酞菁作为该氧化反应的催化剂，当其用量为化合物A2质量的5％时，可以使化合物A3的收率达到70％以上。进一步提高该催化剂的用量，化合物A3的收率还可以有小幅度的上升。但基于控制成本的考量，本发明将该催化剂的用量控制在化合物A2质量的5～8％。也就是说，本发明还提供了一种伊特卡肽关键中间体的合成方法，以Fmoc-Cys(Bzl)-OH为起始原料，Fmoc-Cys(Bzl)-OH与叔丁醇发生酯化反应得到化合物A1，化合物A1通过还原反应得到化合物A2，化合物A2与N-乙酰基-D-半胱氨酸发生氧化反应得到化合物A3。其中，所述氧化反应在氧化剂和催化剂的存在下进行；所述催化剂为氧钛酞菁，用量为化合物A2质量的5～8％。
实施例4
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(3.06g，18.75mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，并加入0.25g氧钛酞菁，分散均匀，随后逐滴滴加碘(12g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应15min。停止反应，过滤反应液，向滤液中加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为94％，收率为72％。
实施例5
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(3.06g，18.75mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，并加入0.3g氧钛酞菁，超声分散均匀，随后逐滴滴加碘(12g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应15min。停止反应，过滤反应液，向滤液中加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为95％，收率为75％。
实施例6
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(3.06g，18.75mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，并加入0.4g氧钛酞菁，超声分散均匀，随后逐滴滴加碘(12g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应15min。停止反应，过滤反应液，向滤液中加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为95％，收率为78％。
对比例1
化合物A3的合成：
分别将化合物A2(5g，12.5mmol)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(3.06g，18.75mmol)溶于100mL 30％醋酸水溶液中，并加入0.5g氧钛酞菁，超声分散均匀，随后逐滴滴加碘(12g/L，12.5mmol)的甲醇溶液，滴加完毕后反应15min。停止反应，过滤反应液，向滤液中加入100mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫代硫酸钠溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，取有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析，得到化合物A3。纯度为95％，收率为78％。
从实施例6和对比例1可以看出，将氧钛酞菁的用量由8％提高至10％，并不会进一步提高化合物A3的收率。但随着氧钛酞菁用量的增大，成本会增加，因此本发明将氧钛酞菁的用量控制在化合物A2质量的8％以内。
本发明将氧钛酞菁作为生成二硫键的氧化反应的催化剂是发明人在研究过程中的偶然发现，因此暂时无法确定氧钛酞菁的催化机理，未来发明人将深入研究其催化机理，期望获得催化效果更高的催化剂以进一步提高化合物A3的收率。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。