技术领域
本发明属于天然药物领域，涉及一种天然小分子的生物活性，以及天然活性分子的用途。
技术背景
亮菌学名假蜜环菌(Armillariella tabescens)。具有抗炎、抗菌、镇痛作用，对胃炎、胆囊炎、胆管炎、阑尾炎、中耳炎等有显著疗效。可以促胆汁分泌、营养肝脏、粘膜，促进人体代谢、增强肝肾功能等，也有滋补强壮作用。
羟基-2-苯基-丙二酰胺（2-hydroxy-2- phenylmalonamide, PHMA）也被称为亮菌乙素或假蜜环菌乙素，其化学结构如下所示。亮菌乙素广泛存在于具有良好的药食兼备功效的假蜜环菌（俗称亮菌）中，据报道，亮菌乙素在假蜜环菌子实体中的含量达干重的 0.25‰，研究表明亮菌乙素对赤霉病菌菌丝生长有较强的抑制作用（Shen Jin-Wen,Ma Bing-Ji,LiWen,etc. Activity of armillarisin B in vitro against plant pathogenicfungi.[J]. Z. Naturforsch., C, J. Biosci., (11): 2-790.）。但其对哺乳动物，尤其是人体的生理活性尚未见报道，在临床中的应用价值也有待进一步研究开发。
式1. 2-羟基-2-苯基-丙二酰胺（2-hydroxy-2- phenylmalonamide, PHMA）
发明内容
本发明的目的是开发天然化合物使用价值。2-羟基-2-苯基-丙二酰胺（2-hydroxy-2- phenylmalonamide,PHMA）是亮菌中的一个次生代谢产物，本发明根据研究过程中发现的生物活性，进一步开发其在食物、药物等方面的用途。本发明PHMA及其衍生物的用途，包括但不限于在制备药物或食物中的用途，应用对象包括所有动物，尤其是脊椎动物，包括人。
本发明所述食品是各种供人食用或者饮用的成品和原料以及按照传统既是食品又是药品的物品。所述的食物包括但不限于普通食品、保健食品、特殊功能医学食品、饮品、食品添加剂、制造食品的原料。所述药品，是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应症或者功能主治、用法和用量的物质，包括中药、化学药和生物制品等。
本发明的PHMA作为食物或药物使用时，可以是纯品作为添加剂加入配方，也可以作为其他原料的一个组分加入配方，含量可以固定的，也可以是一个范围。
本发明的PHMA及其衍生物可以是化学合成物、生物提取物、生物发酵产物。
在一个具体的实施例中，本发明的PHMA是化学合成的，化学合成方法有多种，并已公开，合成方法是本领域技术人员所熟知。
在一个具体的实施例中，本发明的PHMA是生物提取物，例如亮菌，生物提取物方法有多种，并已公开。
在一个具体的实施例中，本发明的PHMA是生物发酵产物，PHMA作为发酵产物中的一个成分发挥活性。
PHMA及其衍生物发挥生物活性的途径有注射、口服等途径。注射途径包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射及其他体腔内注射。为方便注射，PHMA及其衍生物可以做成制剂形式，包括液体注射制剂和干粉针剂。口服途径包括口腔给药、胃肠道给药等，为方便口服，PHMA可以做成制剂形式，包括普通片剂、口服缓释片、口服控释片、胶囊、丸剂、颗粒剂、口服散剂、口服液体制剂、口腔含片等。为更好的发挥生物活性，以上制剂形式又可进一步细分，各种制剂的方法为本领域技术人员熟知。
PHMA微溶于水。可通过加入助溶剂以提高溶解度，助溶剂可以是乙醇，二甲基亚砜等。也可通过加热、搅拌等物理方法增加溶解速度。
PHMA天然产物及其衍生物进入体内后可直接产生活性；或参与代谢，形成有活性的新分子；或者无活性的小分子进入体内后可参与代谢，形成有活性的新分子；或者有活性的小分子进入体内后可参与代谢，形成无活性的新分子。具体的，本发明的活性形式可以是PHMA，在生物体内几乎不被代谢，一般以原型分泌到体外，分泌形式是排泄物，如汗液、尿液、粪便；或仅少于50%，40%，30%，20%，10%，5%参与人体代谢，代谢产物可以是PHMA的酰胺化或酯化或脱氨基或氧化或还原，形成新分子。
本发明首次发现PHMA具有调节神经系统的活性，具体体现在维持动物或者人类睡眠，促进动物或者人类的镇静催眠、安神补脑，治疗和/或预防神经衰弱、焦虑、抑郁、失眠、惊厥或者癫痫药物中的用途。所述镇静作用，其特征包括减少动物的活动频率和活动时长。所述催眠作用，特征包括缩短入睡时间，加快入睡或延长睡眠时间。
本发明所述PHMA能调节神经系统的活性，是指具有安神作用，可用于安神药物用途。包括减少动物在睡眠状态下活动量，例如动物四肢或头部保持长时间静止不动，或延长单次睡眠时长，或延长深度睡眠时间等。
PHMA具有调节神经系统的活性，是具有作用于神经系统生物活性的天然成分，可以用于预防或治疗神经系统疾病和精神类疾病，可以用于制备精神药物或神经系统药物中的用途。
在本发明的一个实施例中，PHMA可以促进哺乳动物，例如小鼠，加快入睡，并使睡眠时间延长。
在本发明的一个实施例中，PHMA可以减少哺乳动物，例如小鼠，的活动量，并能够促进部分小鼠入睡，缩短入睡时间。
在本发明的一个实施例中，PHMA可使哺乳动物，例如小鼠，处于深度入睡状态。在睡眠状态下四肢及躯干无明显位移，活动量减少，处于静息状态，单次睡眠时间延长等。本发明所指的静息状态是指静止休息，动物的四肢、头、尾、躯干、眼皮、嘴巴等无目测明显可见的位置移动，是一种深度睡眠状态。
在一个具体的实施例中，PHMA单独作为药物；在一个具体的实施例中作为复方。在实施例中，PHMA用量可以是500mg/kg体重剂量，也可以是400mg/kg体重、300mg/kg体重、200mg/kg体重、100mg/kg体重、70mg/kg体重、50mg/kg体重、25mg/kg体重，或小于500mg/kg体重的任意剂量。最终剂量根据实际需求和安全性决定。
在一个具体的实施例中，PHMA以溶液形式给药，PHMA在溶液中的浓度为7.0‰，5.0‰，1.0‰，0.5‰，0.1‰，0.05‰，0.01‰。
在一个具体的实施例中，PHMA添加至小鼠饲料中长期喂养，时间为30天，小鼠的体重与不添加PHMA饲养的对照组小鼠体重无显著差异。在一个具体的实施例中，PHMA添加至小鼠的饮用水中长期饮用，时间为30天或30天以上，添加PHMA组小鼠体重与不添加PHMA的对照组小鼠体重无显著差异。饮用水中PHMA的浓度为1.0‰，0.5‰，0.1‰，0.05‰，0.01‰或者更低。
在一个具体的实施例中，PHMA添加至成年斑马鱼的鱼水中，鱼水中PHMA的浓度分别为0.1‰，0.05‰，0.01‰，斑马鱼均可正常存活30天以上，可观察到高剂量组的斑马鱼活动量比低剂量和无PHMA组的斑马鱼活动量少。
在一个具体的实施例中，PHMA添加至成年斑马鱼的鱼水中，鱼水中PHMA的浓度分别为1‰，斑马鱼活动量显著减少，并频繁停止游动处于静止状态，但静止状态下，可见胸鳍有摆动或不摆动。24小时后更换为无PHMA鱼水，斑马鱼恢复正常活动量，并正常存活30天以上。
在25℃时,PHMA在水中的溶解度约为0.7g/100g，在不同温度下水溶液中的溶解度有较大变化。在一个具体的实施例中，加入助溶剂或增溶剂，助溶剂可以是乙醇，二甲基亚砜等，也可以直接溶解在乙醇、二甲基亚砜等溶剂中。
本发明的PHMA，及其偶联化合物，及其可食用或药用盐，在小鼠中能体现出调节神经系统活性，本领域的技术人员熟知，人和小鼠生理特征接近的动物，提示PHMA在人体也能体现一定程度的调节神经系统的活性作用。临床研究经验表明，在小鼠等实验动物中作为药物使用的剂量，在人体中可能会显著不同，包括大幅升高或降低，一般的，在人体中药物的每千克体重给药剂量会显著低于在实验动物中的给药剂量，比如降低为实验动物给药剂量的1/2，1/3，1/5，1/10，1/100等。食品和保健食品、功能食品开发经验表明，在食物中含有的具有特定生物活性的分子，其含量一般显著低于药品，且含量可能不稳定，分布在一个很大的范围。以上不同用途时的含量变化，为本领域技术人员熟知，也在本发明的保护范围内。
本领域技术人员，可合理推测PHMA或其药学上可接受的盐在制备精神或神经系统药物或食物中的用途，例如可以合理推测PHMA在制备诱导和维持动物或者人类入睡、延长睡眠时间或深度睡眠时间、促进动物或者人类的镇静催眠、安神补脑、治疗和/或预防神经衰弱、焦虑、抑郁、失眠、惊厥或者癫痫药物中的用途。
在一个具体的实施例中，将PHMA或含PHMA的提取物或组合物用在制备诱导和维持动物或者人类的睡眠、延长睡眠时间或深度睡眠时间、治疗和/或预防失眠药物中的用途。
在一个具体的实施例中，将PHMA或含PHMA的提取物或组合物用在制备促进动物或者人类的镇静、催眠、安神补脑、治疗和/或预防神经衰弱、焦虑、抑郁、惊厥或者癫痫药物中的用途。
在一个具体的实施例中，将PHMA或含PHMA的提取物或组合物用在安神补脑、增强记忆、滋补强壮、促进睡眠、延长睡眠时间或深度睡眠时间、提高睡眠质量的食物中的用途。
在一个具体的实施例中，将PHMA或含PHMA的提取物或组合物用在安神补脑、增强记忆、滋补强壮、促进睡眠、延长睡眠时间或深度睡眠时间、提高睡眠质量的食品或食品添加剂中的用途。
PHMA的偶联化合物或其可食用或药用盐作也可作为调节神经系统药物或食物。
PHMA的偶联化合物或其可食用或药用盐，在体内可直接产生生物活性，也可以经代谢后产生生物活性，其生物活性包括但不限于镇静、催眠及其他。其代谢可以在体内任意器官，或离体的模拟环境中。
本发明的PHMA偶联化合物或其可食用或药用盐，作为食品或药品使用时，与PHMA一样，可以替代PHMA。
实施方法
以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
实施例1 PHMA直接睡眠实验
约30-35g体重的 CD-1 (ICR)小鼠SPF级分成2组，每组10只。对照组和实验组按0mg/kg、 70 mg/kg腹腔注射生理盐水溶解的PHMA。将小鼠放于独立笼盒中，打开视频监控记录小鼠的活动情况，统计给药后第30-40分钟，小鼠 10 分钟内自由活动次数。以小鼠每次90-180度转身并走动算作活动一次。实验在22℃安静环境下进行。
结果显示，PHMA组小鼠的自主活动次数与对照组比较显著减少。PHMA给药10分钟后，小鼠活动均明显较对照组少，极少在鼠笼两端来回走动，多处于静卧状态，有张望或睡眠行为。轻轻敲击笼盒外侧，对小鼠无明显干扰。可见PHMA对小鼠自主活动有明显的抑制作用。
另外，PHMA组小鼠给药后1小时内静息入睡单次时长超过10分钟达9只，仅一只处于多次短暂静息状态。对照组小鼠活动相对频繁。
PHMA组小鼠给药后单次入睡时长超过10分钟后，进行翻正实验验证。当小鼠置于背卧位时，会立即翻正身位，若超过 1 min不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入深度睡眠状态。结果有5只PHMA组小鼠继续保持睡眠状态超过1分钟，其他4只则在1分钟内有翻正动作，并继续保持静息入睡状态一段时间。而对照组小鼠全部警惕灵活，能立即翻正。
实施例2 PHMA延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间
30-35g体重的昆明小鼠分成2组，每组10只。对照组和实验组分别灌胃生理盐水和生理盐水溶解的7mg/ml PHMA 300ul，50分钟后，所有小鼠均按照36 mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠，记录每只小鼠的睡眠时间。
以小鼠翻正反射消失和翻正反射恢复时间间隔作为睡眠时间。当小鼠置于背卧位时，会立即翻正身位，若超过 1 min不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠，若后续翻正身位，则视为苏醒。实验在22℃安静环境下进行。
实验结果表明，PHMA可以延长小鼠入睡时间，由17.73分钟，延长到38.99分钟，两组差别有统计意义（p<0. 05），PHMA可以延长小鼠睡眠。
实施例3 PHMA影响戊巴比妥钠阈下剂量睡眠实验
30-35g体重的SPF级CD-1 (ICR)小鼠分成2组，每组10只。对照组和实验组分别腹腔注射生理盐水和生理盐水溶解的5 mg/ml PHMA 300 ul （约相当于50 mg/kg体重），20分钟后，按27 mg/kg体重的剂量腹腔注射戊巴比妥钠，记录小鼠在0.5小时内进入睡眠状态的数量。
当小鼠置于背卧位时，会立即翻正身位，若超过 1 min不能翻正者，即认为翻正反射消失，进入睡眠状态。实验在22℃安静环境下进行。
实验结果表明，PHMA可以使小鼠入睡率由20 %提高到90 %，PHMA可以促进小鼠睡眠，可以增加戊巴比妥钠阈下剂量的动物入睡率。