技术领域
本发明涉及一种检测尾水及受纳水体中吗啉的方法，属于水体水质研究的技术领域。
背景技术
吗啉（morpholine），又称为吗啡啉，是一种有机化合物，化学式为C4H9NO，与水混溶，可混溶于多数有机溶剂，在常温下是一种无色油状液体。由于具有氮氧杂环的特点，吗啉在化工生产中占有重要位置，其作为中间化合物或溶剂在各个行业中大量使用，主要用作分析试剂和树脂、蜡类、虫胶、颜料、涂料、洗涤剂、杀虫剂、防虫剂、除草剂等的溶剂。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单整理参考，吗啉被列为第三类致癌物。
由于工业和农业的发展对水体造成了不同程度的污染，导致河流、地表水甚至地下水中均检测到不同浓度的亚硝胺及其前体物。吗啉作为N-亚硝基吗啉（NMOR）的重要前体物，吗啉可以在液相和气相中通过亚硝化反应生成NMOR。而亚硝胺类化合物（如NMOR）具有高毒性和强致癌性，对人类具有高度致突变性和致癌性，亚硝胺类物质不论是大剂量还是多次小剂量的接触，均可以致癌并引发肿瘤。目前，NMOR已被列为2B类致癌物（可能对人类致癌），NMOR作为在城市水系统中最常检测到的亚硝胺之一，且由于NMOR的生物降解率极低，其在污水处理厂中不能得到完全的处理，后续排入受纳水体将会导致下游水体的水质风险，因此开发检测尾水及受纳水体中吗啉的方法十分重要和迫切，可以为研究尾水及受纳水体以及对应水质的风险监控提供有效的检测方法参考。
亚硝胺前体物的来源广泛、种类复杂，是当前国内外亚硝胺研究领域的热点，目前，国内外已有许多检测水体中N-亚硝胺的分析技术，但关于具体的亚硝胺前体物的检测分析技术目前仍处于探索阶段，因此，针对亚硝胺前体物的特点，开发能够快速准确检测吗啉的检测方式是十分必要的。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明公开了一种检测尾水及受纳水体中吗啉的方法，其具体技术方案如下：
一种检测尾水及受纳水体中吗啉的方法，包括以下步骤：
步骤1：水样采集：
从待检测的尾水及受纳水体中采集上覆水水样于棕色玻璃瓶中，在低温避光条件下运回实验室，并在0～4 ℃的避光环境中密封储存，于48 h之内进行水样预处理；
步骤2：水样预处理：
采用固相萃取SPE的方法对样品进行预处理，具体操作如下：
2.1：活化：先对柱子进行活化平衡，保持小柱始终处于湿润状态；
2.2：用移液枪往水样里面加入内标物吗啉-d8溶液；
2.3：上样：用移液枪将含有内标物吗啉-d8的水样加至步骤2.1活化的小柱中，此过程需保持小柱始终处于湿润状态，上样完毕后，低真空度抽干10 min，以去除小柱里面空气中的水分；
2.4：洗脱：用25%氨水/甲醇（5: 95）溶液将吗啉及其内标物吗啉-d8从步骤2.3处理完的小柱中洗脱出来，通过吸引或加压空气除去固相中的水分，流速控制在1滴/s，收集在离心管中；
2.5：富集：将步骤2.4中收集在离心管中的洗脱液，在35℃的氮气流下进行氮吹浓缩，再用甲酸/甲醇（0.1: 99.9）溶液将浓缩液定容至1 mL作为上机液，用于LC/MS/MS分析；
步骤3：制备标准工作曲线：
用甲酸/甲醇（0.1: 99.9）溶液依次稀释吗啉标准上机液（1000 mg/L），制备标准曲线标准液，标准曲线标准液的吗啉浓度梯度为0至200 µg/L，并在每种浓度的标准曲线标准液中添加吗啉-d8，使其达到100 µg/L；
步骤4：采用液相色谱串联四极杆质谱联用LC/MS/MS-MRM (ESI+)方法进行检测：
取标准曲线用的吗啉标准上机液10 µL注入LC/MS/MS，以得到的目标物质吗啉与内标物吗啉-d8的浓度比作为横坐标，目标物质吗啉与内标物吗啉-d8的检测峰面积比作为纵坐标，制作标准曲线，得到线性回归方程和拟合优度R2，取10 µL步骤2.5制备的上机液注入LC/MS/MS，根据目标物质吗啉与内标物吗啉-d8的面积比，通过标准曲线进行定量计算水样中的吗啉浓度。
进一步的，所述步骤2.1活化的具体过程为：依次使用6 mL甲醇、15 mL纯水活化，用滴管滴入萃取小柱，以3 mL/min的流速缓慢通过萃取小柱，加压或抽真空以使溶剂流干，此过程保持小柱始终处于湿润状态。
进一步的，所述LC/MS/MS上机检测的流动相A的配置方法为：配制1.0 mL的色谱级甲酸，加超纯水定容至1000 mL，即可得到0.1 %的甲酸水溶液，流动相使用前需要进行超声处理10 min，以排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响色谱柱的性能；流动相B选用100%甲醇。
进一步的，所述步骤2.2中的替代标准液内标物吗啉-d8溶液的配制方法如下：先将50 mg内标物吗啉-d8溶液溶于50 mL的水中，再用甲酸/甲醇（体积比0.1: 99.9）溶液进行准确稀释，再用其配制1000 mg/L的替代物内标准原液新制备为1 mg/L的替代物内标准液；
步骤2.4中25%氨水/甲醇溶液的配制方法如下：按照25 %氨水：甲醇的体积比为5:95的比例，于500 mL容量瓶内混合配制成500 mL溶液，即25 %氨水25 mL，甲醇475 mL；
步骤2.5中甲酸/甲醇溶液的配制方法如下：按照甲酸：甲醇体积比为0.1: 99.9的比例混合，于1000 mL容量瓶内配制成1000 mL的溶液，即甲酸1 mL，甲醇999 mL。
进一步的，所述步骤3中吗啉标准上机液的配制方法如下：称取10 mg吗啉标准品，用10 mL甲酸/甲醇（体积比0.1: 99.9）稀释，配制成1000 mg/L的标准储备溶液；
所述步骤4中标准曲线用的吗啉标准上机液的配制方法如下：用甲酸/甲醇（体积比0.1: 99.9）溶液依次稀释标准原液，制备标准曲线用标准上机液。
进一步的，所述步骤3中标准曲线用标准液的浓度梯度为：0, 0.3, 0.8, 1.5, 3,6, 10, 25, 50, 100, 200 µg/L，在每种浓度的标准曲线标准液中添加吗啉-d8，使其达到100 µg/L。
进一步的，所述步骤4中拟合优度R2至少达到0.99。
进一步的，所述预处理过程的固相萃取SPE的固相萃取小柱采用Waters OasisMCX，3 cc/60 mg, 30 μm。
进一步的，所述步骤4中标准曲线用标准上机液检测具体过程为：进样后，样品通过液相色谱柱对样品中的物质进行分离，然后进入质谱仪器进行鉴定吗啉和吗啉-d8；
液相分离的液相色谱柱采用AQ-C18液相色谱柱，质谱仪器采用三重四级杆的质谱仪器。
进一步的，所述液相色谱检测和质谱检测参数如下：
（1）液相色谱条件：
色谱柱：GL Science AQ-C18, 2.1 × 100 mm, 1.9 µm；
流动相：A: 0.1%甲酸，B: 100%甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
洗脱程序：B: 5% (0 min) → 5% (2 min) →90% (4 min) → 5% (6 min)；
柱温：40℃；
样品室温度：10 ℃；
进样量：10 µL；
流速：0.1 mL/min；
（2）质谱条件：
质谱仪：四极杆质谱仪；
离子源：电喷雾离子源；
毛细管电压：1 kV；
脱溶剂气-氮气温度：400 ℃；
脱溶剂气流量：900 L/hr；
雾化器压力：45 psi；
锥孔气流量：50 L/hr；
扫描方式：多反应检测扫描模式；
质谱（MRM）参数：
本发明的工作原理是：
吗啉又称为吗啡啉，是一种有机化合物，化学式为C4H9NO，是强致癌性亚硝胺（N-亚硝基吗啉）的重要前体物。
本发明预处理部分采用固相萃取（Solid Phase Extraction, SPE），其原理是利用固相萃取材料对目标化合物的亲和性，将其从样品中吸附出来，然后用适当的溶剂洗脱出来，得到纯净的目标化合物。本发明涉及到的固相萃取小柱采用Waters Oasis MCX，3cc/60 mg, 30 μm，这种柱子是一种混合型阳离子交换固相萃取小柱，对碱性化合物具有高度的选择性和灵敏度，用于萃取具有阳离交换基团的碱性化合物，其基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，由于Oasis MCX吸附剂具有水可浸润性，因此即使吸附剂干涸，也能保持较高的保留能力和出色的回收率，同时这些多功能的小柱可以轻松连接到泵和注射器上，实现可靠的正压流动，从而加快样品处理速度。检测系统部分采用液相色谱串联四极杆质谱联用（LC/MS/MS-MRM (ESI+)）法进行检测，其基本原理是将色谱和质谱联用，实现在分析基质中快速、高效的制备和分离目标化合物，并通过质谱仪器进行鉴定。在进样后，样品通过分离柱对样品中的物质进行分离，然后进入质谱仪器。液相分离的主要部件是液相色谱柱，本发明采用AQ-C18液相色谱柱，InertSustain AQ-C18是在拥有高惰性和高耐久性的同时，针对提高极性化合物保留能力而设计的C18柱。该色谱柱严格控制C18长链间隔距离，以确保即使在高比例水相条件下，固定相和流动相依然有足够的接触面，避免C18固定相产生“疏水塌陷”的问题，从而提高极性化合物的保留能力。质谱的主要部件是四级杆，该部件可用于选择性地传输一个特定的离子：首先，高压直流电源生成的强电场会引导离子进入四级杆，接着，根据四级杆的稳定电压和波形，选择性地传输只具有特定质荷比的离子，通过调节四级杆的电源参数，可以选择传输特定的目标离子，达到定性和定量的目的，以获得更准确和可靠的化合物分析结果。该技术具有高效、准确、可靠、多样性和通用性等优点，其在药物、天然产物、蛋白质和环境分析领域中有着广泛的应用前景。
本发明的有益效果是：
本发明在水样预处理阶段，采用固相萃取法SPE对水样进行预处理，具有回收率和富集倍数高，有机溶剂消耗少，可以减少对环境的污染，操作简便、快捷、费用低，易于实现自动化及与其他分析仪器联用等优点。固相萃取柱使用Waters Oasis MCX小柱，3 cc/60mg, 30 μm，Oasis MCX是一种新型的混合型聚合物吸附剂，能够克服传统硅胶基质混合型固相萃取吸附剂的局限性，经过优化，可以获得更高的选择性和灵敏度，其提供了双重保留模式：离子交换和反相，而且保留作用发生在一种洁净、稳定、高表面积、在pH 0-14范围内稳定的有机共聚物上。
本发明建立了用LC/MS/MS-MRM (ESI+)来测定尾水及受纳水体中吗啉，液相分离部分采用的液相色谱柱为InertSustain AQ-C18，该色谱柱使用的高惰性填料几乎适用于任何分析，都能得到尖锐对称的峰形，且能在宽pH范围情况下分析。该检测方法能够定性定量的检测尾水及受纳水体中的吗啉，具有灵敏度高、准确度高、分析速度快、定量准确的优点。该仪器检测的具体参数是我们经过多次实验得到的最优参数，能够快速准确的测得尾水及受纳水体中吗啉的含量，且加标回收率能达到90%，拟合优度R2达到0.9998。
本发明是国内第一个关于强致癌性N-亚硝基吗啉前体物的检测方法，检测对象则是污水处理厂尾水及受纳水体中的吗啉，适用于检测污水中的吗啉，可应用于尾水及受纳水体水质的相关研究以及对应水质风险的监控，更具有实际应用效益。
附图说明
图1为检测方法的流程图。
图2为吗啉的标准曲线图，标曲浓度范围设置在0-200 µg/L，能满足绝大部分环境水样检测的要求。
图3为样品中吗啉的MRM质谱图。
图4为样品中吗啉-d8的MRM质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1
采样地点：江苏省南京市；采样时间：2023年10月17日。
一种检测尾水及受纳水体中吗啉的方法，步骤如下：
（1）配制所需试剂：
浓度为0.1 %的甲酸、浓度为10 mmol/L的甲酸铵：分别在超纯水中溶解甲酸和甲酸铵，制备成0.1%的甲酸和10 mmol/L的甲酸铵；
甲酸/甲醇（0.1: 99.9）溶液：按照甲酸：甲醇体积比为0.1: 99.9的比例混合，配制成1000 mL的溶液；
25 %氨水/甲醇（5: 95）溶液：按照25 %氨水：甲醇体积比为5: 95的比例混合，配制成500 mL溶液；
甲酸/甲醇（4: 96）溶液：按照甲酸：甲醇体积比为4:96的比例混合，配制成500 mL溶液。
（2）配制标准溶液：
准确称取10 mg吗啉标准品，用10 mL甲酸/甲醇（0.1: 99.9）稀释，配制成1000mg/L的标准储备溶液，即标准原液。
（3）配制标准曲线用标准液：
用甲酸/甲醇（0.1: 99.9）溶液依次稀释标准原液，制备标准曲线用标准液。标准曲线用标准液的浓度梯度为：0，0.3，0.8，1.5，3，6，10，25，50，100，200 µg/L，在每种浓度的标准曲线标准液中添加吗啉-d8，使其在溶液中浓度达到100 µg/L。
（4）配制替代内标准液：
准确称取10 mg替代物内标准物质吗啉-d8，用10 mL甲酸/甲醇（0.1: 99.9）稀释，配制成1000 mg/L的替代物内标准原液，再用甲酸/甲醇（0.1: 99.9）溶液进行准确稀释，新制备为1 mg/L的替代物吗啉-d8内标准液。
（5）制备标准工作曲线：
取标准曲线用标准液10 µL注入LC/MS/MS，以得到的目标物质吗啉的浓度作为横坐标，目标物质吗啉与替代内标准物质吗啉-d8的面积比作为纵坐标，制作标准曲线，得到线性回归方程和拟合优度R2。
（6）LC/MS/MS-MEM (ESI+)检测分析：利用液相色谱串联四极杆质谱联用仪（LC/MS/MS-MEM (ESI+)）对进样瓶中的溶液进行分析：（1）色谱条件：采用GL Science AQ-C18色谱柱（2.1 × 100 mm, 1.9 µm）；柱温：40 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量：10 µL；流速0.1mL/min；流动相A: 0.1%甲酸；流动相B: 100%甲醇；梯度洗脱程序：B: 5% (0 min)→ 5% (2min)→90% (4 min)→ 5% (6 min)；（2）质谱参数：毛细管电压（capilaryvoltage）:1 kV；脱溶剂气温度（desolvationtemperature）: 400 ℃；脱溶剂气流量）desolvationgasflow）：900 L/hr；雾化器压力（nebulizerpressure）: 45 psi；锥孔气流量（conegasflow）: 50 L/hr。MRM采集参数如表1所示：
表1 吗啉及吗啉-d8的质谱（MRM）参数
采集数据，绘制标准工作曲线：
参见图2，标准曲线用标准液的浓度梯度为：0，0.3，0.8，1.5，3，6，10，25，50，100，200 µg/L，在每种浓度的标准曲线标准液中添加吗啉-d8，使其达到100 µg/L。采用上述LC/MS/MS-MRM (ESI+)的检测方法对上述不同浓度的样品进行分析，以得到的目标物质的浓度作为横坐标，目标物质与替代内标准物质的面积比作为纵坐标，制作标准曲线，得到线性回归方程和拟合优度R2。
回收率实验：往已知浓度的待测样品溶液中添加小体积大浓度（添加浓度为原样品浓度的1或2倍）的标准物质，进行LC/MS/MS-MRM (ESI+)检测，计算其回收率R，计算公式如下：
R=(C2-C1)/C0*100%
式中：C2为加标样品中目标物质的浓度；C1为样品未加标前目标化合物的浓度；C0为加标量。
表2 吗啉的标准工作曲线和加标回收率
方法学验证结果：如表2所示，吗啉在线性范围内线性拟合情况良好：化合物的回收率在80%~120%范围内，检测方法可靠。
附图3为吗啉的质谱图、附图4为吗啉-d8的质谱图，检测结果显示，吗啉与其相应的标准物吻合良好。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。