技术领域
本发明涉及一种发酵生产Aspochalasin D的方法,属于微生物和发酵技术领域。
背景技术
Aspochalasin D是一种聚酮氨基酸杂合的天然产物，其主要来源之一是黄柄曲霉。该化合物具有典型的细胞松弛素活性，能够特异性结合肌动蛋白。此外，该化合物还具有抗菌、抗癌、抗污以及抑制5羟色胺释放等活性。因此在农业和药物开发方面具有巨大的应用前景。
目前，Aspochalasin D有化学合成和微生物发酵两种方法制备。化学合成方法步骤繁多且反应条件复杂，难以高效制备。微生物发酵法受限于野生型菌株有限的合成能力且还有其他副产物产生，导致发酵产量低下。因此，急需开发一种高效发酵生产AspochalasinD的方法。
发明内容
由于野生型黄柄曲霉的Aspochalasin D产量低且副产物较多，而目前没有方法能有效提高Aspochalasin D产量。
为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产AspochalasinD的方法。此方法通过发酵工艺优化和基因编辑技术,提高黄柄曲霉Aspochalasin D的生产效率，减少黄柄曲霉合成Aspochalasin D的副产物。利用本发明的方法提高了黄柄曲霉的Aspochalasin D的产量。
本发明提供了一种重组黄柄曲霉，所述重组黄柄曲霉是以黄柄曲霉CGMCC3.17641为表达宿主，敲除其基因组上的aspoA基因，并且整合表达了含有来源于自身的转录调控因子aspoG的过表达盒。
在本发明的一种实施方式中，所述aspoA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述表达盒由来自构巢曲霉的启动子PgpdA、终止子TcgrA和aspoG基因构成，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种发酵生产Aspochalasin D的方法，所述方法为，将所述的黄柄曲霉CGMCC 3.17641或所述重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，发酵制备AspochalasinD。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：10-50g/L葡萄糖、1-5g/L大豆蛋白胨、1-3g/L乙酸钠、0.5-3g/L亮氨酸、1-9mg/L L-苯丙氨酸、20-180mg/L苯甲酸钠、100-200mg/L磷酸二氢钾、0.5-1.5mg/L生物素、3-10mg/L硝酸钙、0.5-1.5mg/L磷酸吡哆醛、0.5-1.5mg/L泛酸钙、0.5-1.5mg/L盐酸硫胺素、1-9mg/L氯化锰、1-3mg/L氯化铁、0.5-1.5mg/L硝酸铜、0.5-4.5mg/L硫酸镁、1-4mg/L硫酸锌。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：25.2/L葡萄糖、3g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、1.4g/L亮氨酸、5mg/L L-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、3.6mg/L硫酸镁、2.5mg/L硫酸锌。
在本发明的一种实施方式中，所述黄柄曲霉CGMCC 3.17641或重组黄柄曲霉的添加量为：106～108个孢子。
在本发明的一种实施方式中，将所述黄柄曲霉CGMCC 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为21～31℃，初始pH为6.0-8.0，转速为100～160r/min的条件下进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，将所述黄柄曲霉CGMCC 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为29℃，初始pH为6.0-8.0，转速为135r/min的条件下进行发酵。
本发明还提供了上述重组黄柄曲霉或上述黄柄曲霉CGMCC 3.17641在制备Aspochalasin D或含有Aspochalasin D产品中的应用。
有益效果
本发明对温度、时间、pH、碳源、氮源、亮氨酸浓度等发酵工艺优化，并使用敲除aspoA基因并过表达aspoG基因获得的黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株，大幅提升了Aspochalasin D的产量。利用本发明方法发酵生产Aspochalasin D，可以使AspochalasinD的产量最高达到812.1mg/L，在农业和制药业方面具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为Aspochalasin D的结构图。
图2为黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株平板形态。
图3为Aspochalasin D 1H谱。
图4为Aspochalasin D 13C谱。
图5为温度对Aspochalasin D产量的影响。
图6为时间对Aspochalasin D产量的影响。
图7为初始pH对Aspochalasin D产量的影响。
图8为碳源对Aspochalasin D产量的影响。
图9为氮源对Aspochalasin D产量的影响。
图10为亮氨酸浓度对Aspochalasin D产量的影响。
图11为pXS-ΔaspoA质粒图谱。
图12为敲除aspoA的PCR验证。
图13为pUCgpdA-OEaspoG质粒图谱。
图14为过表达aspoG的PCR验证。
图15为优化发酵培养条件下黄柄曲霉及突变株的Aspochalasin D发酵曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
本发明制备得到的Aspochalasin D的结构图如图1所示，Aspochalasin D 1H谱、Aspochalasin D 13C谱图分别如图3和图4所示。
下述实施例中设计的培养基如下：
S-7固体培养基：15-20g/L琼脂、20g/L葡萄糖、2g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、5mg/LL-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、3.6mg/L硫酸镁、2.5mg/L硫酸锌。
S-7液体发酵培养基：20/L葡萄糖、2g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、5mg/L L-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、硫酸镁3.6mg/L、硫酸锌2.5mg/L。
S-7优化发酵培养基：25.2/L葡萄糖、3g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、1.4g/L亮氨酸、5mg/L L-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、硫酸镁3.6mg/L、硫酸锌2.5mg/L。
遗传霉素抗性筛选培养基：4g/L PDA，0.5g/L琼脂，250mg/L遗传霉素。
博莱霉素抗性筛选培养基：4g/L PDA，0.5g/L琼脂，100mg/L博莱霉素。
下述实施例中使用的缓冲液如下：
渗透缓冲液：1.42g磷酸氢二钠和144g硫酸镁，溶于去离子水，1000mL蒸馏水定容备用；0.276g磷酸二氢钠和29g硫酸镁，溶于去离子水，200mL蒸馏水定容备用，将两配制好的溶液混合调节至PH＝5.8。
STC缓冲液：218.6g山梨醇，0.47g氯化钙，1000mL蒸馏水定容，过滤灭菌，4℃冰箱保存。
PEG6000缓冲液：250g PEG6000，11.098g氯化钙，44.73g氯化钾，1000mL蒸馏水定容，过滤灭菌，4℃冰箱保存
实施例1：黄柄曲霉CGMCC 3.17641制备Aspochalasin D的方法
具体步骤如下：
1、温度对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制100mL S-7液体发酵培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于步骤(2)的摇瓶中，分别放置于21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、31℃，135rpm的摇床中培养5天，取适量发酵液检测。
结果如图5所示，当培养温度为29℃时，Aspochalasin D产量最高达到58.2mg/L。
2、时间对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制100mL S-7液体发酵培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于步骤(2)的摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养，在培养的2到9天取适量发酵液检测。
结果如图6所示，当培养时间为7天时，Aspochalasin D产量最高达到80.3mg/L。
3、初始pH对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)分别配制初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的100mL S-7液体发酵培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于步骤(2)的摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养7天，取适量发酵液检测。
结果如图7所示，当初始pH为8.0时，Aspochalasin D产量最高达到82.1mg/L。
4、碳源对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制发酵培养基：
将初始pH为8.0的100mL S-7液体发酵培养基中的碳源20g/L葡萄糖分别调整为果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉，浓度均为：20g/L；
分别将上述发酵培养基置于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于步骤(2)的摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养7天，取适量发酵液检测。
结果如图8所示，当碳源为葡萄糖时，Aspochalasin D产量最高达到84.2mg/L。
5、氮源对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制发酵培养基：
将初始pH为8.0的100mL S-7液体发酵培养基中的氮源2g/L大豆蛋白胨分别调整为酵母浸膏、胰蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、尿素，浓度为：2g/L；
分别将上述液体发酵培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养7天，取适量发酵液检测。
结果如图9所示，当氮源为大豆蛋白胨时，Aspochalasin D产量最高达到84.2mg/L。
6、亮氨酸浓度对Aspochalasin D产量的影响
(1)将黄柄曲霉CGMCC 3.17641接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制发酵培养基：
将初始pH为8.0的100mL S-7液体发酵培养基中的0g/L亮氨酸分别调整为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L。
分别将上述液体发酵培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养7天，取适量发酵液检测。
结果如图10所示，当亮氨酸浓度为1.5g/L时，Aspochalasin D产量最高达到188.6mg/L。
7、响应面法优化液体培养基
选用响应面法常用的Box-Behnken design，使用Design-Expert软件进行实验设计与结果分析。选择葡萄糖、大豆蛋白胨和亮氨酸浓度三个因素三个水平设计实验进行优化。根据软件设计进行实验，并将实验结果输入软件进行分析建立数学模型。
根据数学模型预测，当S-7液体发酵培养基中的葡萄糖浓度25.2g/L、大豆蛋白胨浓度3.0g/L、亮氨酸浓度1.4g/L时，预测Aspochalasin D产量最高为202.5mg/L；即：S-7液体发酵培养基为：25.2/L葡萄糖、3g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、1.4g/L亮氨酸、5mg/LL-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、硫酸镁3.6mg/L、硫酸锌2.5mg/L。
对软件最优条件进行验证，结果如图15所示，实际第7天Aspochalasin D产量为199.2mg/L，与软件预测相符。
实施例2：黄柄曲霉ΔaspoA突变株的构建
(1)黄柄曲霉原生质体制备
将黄柄曲霉接种于S-7平板上，平板放于25℃恒温培养箱中培养7-14天。平板用无菌水清洗以制备孢子悬液，孢子悬液接种于装有90mLS-7液体发酵培养基的250mL摇瓶中，放置于29℃，135rpm的恒温摇床培养18h。菌液置于离心管中8000rpm离心15min以收集菌体。菌体用适量渗透缓冲液清洗，随后8000rpm离心15min，重复2-3次。加入10mL含有200mg溶壁酶的渗透缓冲液，在29℃，135rpm的恒温摇床中孵育3h。将孵育后的菌液用5-7层的无菌纱布过滤，滤液加入等体积STC缓冲液，5000rpm离心15min，倒掉上清液。加入2倍酶解液体积的STC缓冲液，6000rpm离心8min，倒掉上清液。加入适量STC缓冲液，使用血球计数板计数确保原生质体数量为每毫升106个，最后分装置于-80℃保存。
(2)敲除片段制备
从黄柄曲霉基因组中找到aspoA基因阅读框，克隆aspoA基因阅读框上下游2000bp片段，上下游序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，遗传霉素抗性表达盒序列如SEQIDNO.5，按照上游序列、遗传霉素抗性表达盒和下游序列整合进载体pXS(公开于Liu J,Chai X,Guo T,Wu J,Yang P,Luo Y,Zhao H,Zhao W,Nkechi O,Dong J,Bai J,Lin Q(2019)Disruption of the ergosterol biosynthetic pathway results in increasedmembrane permeability,vausing overproduction and secretion of extracellularMonascus Pigments in submerged fermentation.JAgric Food Chem 67(49):13673-13683doi:https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b05872)，得到完整质粒pXS-ΔaspoA(图11)。以完整质粒pXS-ΔaspoA为模板，用引物pXS-D-F(5’-GCGAATTGGGTACCGGTCGAC-3’)和pXS-D-R(5’-TTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT-3’)进行PCR扩增包含上下游序列和遗传霉素抗性基因的敲除片段，PCR反应采用50μL体系：2μL正向引物，2μL反向引物，1μL模板，20μL双蒸水和25μL 2x Prime Star Max premix(日本，Takara)。按照厂家提供说明书设置PCR程序：变性，98℃，10s；退火，58℃，10s；延伸，72℃，30s，重复30个循环，最后额外72℃延伸10min。扩增的敲除片段纯化回收后备用。
(3)黄柄曲霉原生质体转化
取150μL黄柄曲霉原生质体，加入等体积溶解有20μg敲除片段的STC缓冲液，混匀后，在冰上孵育1h。加入1.25mL的PEG6000缓冲液，混匀后放入29℃，135rpm的恒温摇床中孵育20min。加入6mL 1.2mol/L山梨醇的PDB，在29℃，135rpm的恒温摇床中培养约12h。7500rpm离心15min，倒掉多余上清液后，涂布在含有遗传霉素的平板上。
(4)重组子筛选
将抗性平板筛选出的转化子液体培养，随后收集菌丝提取基因组，以转化子的基因组为模板用引物testA-F(5’-GCTTTCTCTTCCTGGCTCGTAGAT-3’)和testA-R(5’-TCGGTGTGATCATCCATACAGCAACA-3’)进行PCR验证，PCR反应采用20μL体系：1μL正向引物，1μL反向引物，1μL模板，7μL双蒸水和10μL 2x ES Taq MasterMix(中国，康为世纪)。按照厂家提供说明书设置PCR程序：变性，98℃，10s；退火，58℃，10s；延伸，72℃，90s，重复30个循环，最后额外72℃延伸10min。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果如图12所示，以黄柄曲霉CGMCC 3.17641野生型为对照，阳性转化子的扩增片段在2000bp左右，小于野生型的扩增片段，证明转化子中aspoA基因被成功替换为遗传霉素抗性表达盒。
制备得到黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株。
实施例3：黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株的发酵生产Aspochalasin D
具体步骤如下：
(1)将实施例2制备得到的黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制优化后的100mL S-7液体培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
S-7优化发酵培养基为：25.2/L葡萄糖、3g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、1.4g/L亮氨酸、5mg/L L-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、硫酸镁3.6mg/L、硫酸锌2.5mg/L。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于步骤(2)的摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养，取发酵液检测。
结果如图15所示，黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株在优化的发酵培养条件下第7天产量最高达到325.3mg/L。
实施例4：黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株的构建
(1)过表达质粒构建
从黄柄曲霉基因组中克隆完整aspoG基因阅读框，aspoG基因序列如SEQ ID NO.6，按照博莱霉素抗性表达盒、启动子PgpdA、aspoG基因和终止子TcgrA的顺序连接整合进载体pUC(保藏于江南大学实验室)构成完整质粒pUCgpdA-OEaspoG(图13)，博莱霉素抗性表达盒序列如SEQ ID NO.7，来自构巢曲霉的启动子PgpdA序列如SEQ ID NO.8,来自构巢曲霉的终止子TcgrA序列如SEQ ID NO.9。
(2)黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株原生质体制备
将实施例2制备得到的黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株接种于S-7平板上，平板放于25℃恒温培养箱中培养7-14天。平板用无菌水清洗以制备孢子悬液，孢子悬液接种于装有90mL S-7液体发酵培养基的250mL摇瓶中，放置于29℃，135rpm的恒温摇床培养18h。菌液置于离心管中8000rpm离心15min以收集菌体。菌体用适量渗透缓冲液清洗，随后8000rpm离心15min，重复2-3次。加入10mL含有200mg溶壁酶的渗透缓冲液，在29℃，135rpm的恒温摇床中孵育3h。将孵育后的菌液用5-7层的无菌纱布过滤，滤液加入等体积STC缓冲液，5000rpm离心15min，倒掉上清液。加入2倍酶解液体积的STC缓冲液，6000rpm离心8min，倒掉上清液。加入适量STC缓冲液，使用血球计数板计数确保原生质体数量为每毫升106个，最后分装置于-80℃保存。
(3)黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株原生质体转化
取150μL黄柄曲霉CGMCC 3.17641ΔaspoA突变株原生质体，加入等体积溶解有10μg质粒pUCgpdA-OEaspoG的STC缓冲液，混匀后，在冰上孵育1h。加入1.25mL的PEG6000缓冲液，混匀后放入29℃，135rpm的恒温摇床中孵育20min。加入6mL 1.2mol/L山梨醇的PDB，在29℃，135rpm的恒温摇床中培养约12h。7500rpm离心15min，倒掉多余上清液后，涂布在含有博莱霉素的平板上。
(4)重组菌株筛选
将抗性平板筛选出的转化子液体培养，随后收集菌丝提取基因组，以转化子的基因组为模板用引物OEaspoG-F(5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCAC-3’)和OEaspoG-R(5’-TGCATGGCAGACACTGAAGCAACAGC-3’)进行PCR验证，PCR反应采用20μL体系：1μL正向特异性引物，1μL反向特异性引物，1μL模板，7μL双蒸水和10μL 2x ES Taq MasterMix(中国，康为世纪)。按照厂家提供说明书设置PCR程序：变性，98℃，10s；退火，58℃，10s；延伸，72℃，120s，重复30个循环，最后额外72℃延伸10min。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果如图14所示，以黄柄曲霉CGMCC 3.17641野生型和ΔaspoA为对照，没有扩增片段，阳性转化子的扩增片段在3500bp左右，证明转化子基因组中成功整合了aspoG过表达盒。
制备得到黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株(平板形态如图2所示)。
实施例5：黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株发酵生产Aspochalasin D
具体步骤如下：
(1)将黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株接种在S-7固体培养基上，放置于25℃生长7-14天。
(2)配制优化后的100mL S-7液体培养基于250mL摇瓶中，在115℃下灭菌15min，冷却备用。
S-7优化发酵培养基为：25.2/L葡萄糖、3g/L大豆蛋白胨、1g/L乙酸钠、1.4g/L亮氨酸、5mg/L L-苯丙氨酸、100mg/L苯甲酸钠、136mg/L磷酸二氢钾、1mg/L生物素、6.5mg/L硝酸钙、1mg/L磷酸吡哆醛、1mg/L泛酸钙、1mg/L盐酸硫胺素、5mg/L氯化锰、2mg/L氯化铁、1mg/L硝酸铜、硫酸镁3.6mg/L、硫酸锌2.5mg/L。
(3)用灭菌水清洗步骤(1)的平板以制备孢子悬液，用血球计数板计数约107个孢子接种于摇瓶中，放置于29℃，135rpm的摇床中培养，取发酵液检测。
结果如图15所示，黄柄曲霉ΔaspoA::OEaspoG突变株在优化的发酵培养条件下第7天产量最高达到812.1mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。