技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法及应用。
背景技术
复方氨基酸注射液为常见的一种肠外营养注射液，在临床上应用范围较广。由于其成分复杂，尤其是其中的色氨酸不太稳定，易氧化降解导致产生杂质，导致产品质量不稳定，进而影响患者的用药安全。吲哚-3-甲醛作为潜在的降解杂质，其含有警示结构，经查询，Derek数据库显示其致突变为阴性，Sarah数据库显示为阳性，对人体具有潜在的致突变影响，故将该杂质按潜在致突变杂质进行研究，控制限度要求严格，其结构式如下：
现有文献资料中未查询到复方氨基酸品种吲哚-3-甲醛的检测方法，由于复方氨基酸注射液中含有多达10余种甚至更多的氨基酸，成分复杂，故需要单独建立一种方法针对吲哚-3-甲醛进行检测，才能有效地检测出复方氨基酸制剂中的吲哚-3-甲醛含量。
发明内容
本发明是为了解决现有技术缺少对复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法问题，目的在于提供一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法及应用，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛，从而提高相关复方氨基酸注射液临床用药的安全性。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明第一个目的在于提供一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，用流动相进行等度洗脱，紫外检测器检测，检测波长为301-311nm，流动相流速为0.6 -1.0mL/min，进样量为50 -150μL，柱温为30-40℃。
进一步地，所述流动相为乙腈和浓度为0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液的混合溶液。
进一步地，所述流动相中磷酸盐缓冲溶液包括磷酸二氢钠和磷酸二氢钾的一种或两种。
进一步地，所述流动相中磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为65-75:25-35。
进一步地，所述流动相中的磷酸盐缓冲溶液的pH范围为4.1-4.5。
进一步地，所述流动相的pH调节剂为磷酸。
进一步地，所述检测波长为306nm，流动相流速为0.8mL/min，进样量为100μL，柱温为35℃。
进一步地，所述色谱柱为MGⅡC18 4.6 mm×250mm，5µm。
进一步地，所述吲哚-3-甲醛回收率大于90%，吲哚-3-甲醛附近无干扰峰。
本发明第二个目的在于提供上述检测方法在检测复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1.本发明通过利用高效液相色谱法，结合该杂质响应低、极性小的特点，针对性选择流动相比例及pH、流速、柱温、波长、进样量等色谱条件，有效的实现了吲哚-3-甲醛的基线分离（分离度≥1.5），并实现了该杂质准确的定量检测。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛，从而提高相关复方氨基酸注射液临床用药的安全性。
2.吲哚-3-甲醛含有警示结构，对人体具有潜在的致突变影响，控制限度要求非常严格，导致该杂质限度非常低（≤0.0013%）。而本发明具有较高的灵敏度，该杂质定量限可达到0.001614μg/mL，有效保证检测结果的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
图1为吲哚-3-甲醛对照品溶液的HPLC示意图；
图2为吲哚-3-甲醛系统适用性溶液的HPLC示意图。
图3为实施例2中吲哚-3-甲醛的线性关系图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
本实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，用流动相进行等度洗脱，紫外检测器检测。
其中检测波长为301-311nm，比如可以为301 nm、303 nm、305 nm、307 nm、309 nm、311nm以及任意两个值之间组成的任意范围，优选为304-308nm，最优选为306nm。
其中流动相流速为0.6-1.0mL/min，比如可以为0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0mL/min，优选为0.7-0.9mL/min，最优选为0.8mL/min。
其中进样量为50 -150μL，比如可以为50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、105μL、110μL、115μL、120μL、125μL、130μL、135μL、140μL、145μL、150μL，优选为80-120μL，最优选进样量为100μL。
其中柱温为30-40℃，比如可以为30℃、32℃、35℃、38℃和40℃，优选柱温为35℃。
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱以硅胶为基质，表面键合十八烷基长链（C18），形成高密度疏水层。多组分药物在流动相（水/有机溶剂）驱动下，因各组分与C18链的疏水作用力差异实现分离，对非极性物质有较强的保留效果。本发明中，吲哚-3-甲醛为非极性物质，因此采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱相较于其他色谱柱会有更好的分离效果。
其中，流动相为乙腈和浓度为0.01-0.03mol/L的磷酸盐缓冲溶液的混合溶液，优选地，流动相的磷酸盐缓冲溶液度为0.02mol/L；
进一步地，本实施例中流动相中磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为65-75:25-35，优选地，所述流动相中磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为70:30；
进一步地，流动相的pH值为4.1-4.5，优选地，流动相的pH为4.3，pH调节剂为磷酸。
作为一种优选的实施方式，本实施方式提供的一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，包括：采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，用流动相进行等度洗脱，紫外检测器检测，检测波长为306nm，流动相流速为0.8mL/min，进样量为100μl，柱温为35℃。
其中，流动相为乙腈与磷酸盐缓冲溶液的混合溶液。所述流动相为乙腈和浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液的混合溶液；其中，磷酸盐缓冲溶液与乙腈的体积比为70：30。磷酸盐缓冲溶液包括磷酸二氢钠和磷酸二氢钾的一种或两种。即包括磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸二氢钾缓冲溶液或者磷酸二氢钠和磷酸二氢钾的混合溶液三种形式。流动相的pH=4.3，pH调节剂为磷酸。
实施例1：专属性实验
关于溶液的配制
对照品贮备液：取吲哚-3-甲醛对照品约3.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置20ml于量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置100ml于量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
灵敏度溶液：精密量取对照品贮备液2ml，置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得灵敏度溶液。
系统适用性溶液：分别精密量取本品5ml、对照品贮备液1ml，共置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性溶液。
供试品溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
其中，本品指复方氨基酸注射液（18AA-Ⅸ），由四川科伦药业股份有限公司提供。
一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件为：
色谱柱：资生堂MGⅡC18 4.6 mm×250mm，5µm；
流动相：0.02mol/L的磷酸二氢钾（用磷酸调pH值至4.3）-乙腈，其中磷酸二氢钾与乙腈的体积比为70：30；
稀释剂：流动相；
波长：306nm；
柱温：35℃；
流动相流速：0.8mL/min；
进样量：100μL；
等度洗脱25min。
本发明选用等度洗脱的方式，操作更为便捷，中间无需切换梯度，色谱稳定性良好。
其中选择的MGⅡC18色谱柱具有以下优点：采用包被技术，实现对硅醇基的深度封锁，显著减少碱性化合物与固定相的次级相互作用，从而在中性流动相条件下获得尖锐、对称的色谱峰，解决传统ODS柱分析碱性物质时拖尾的难题。另外色谱柱疏水性适中，对酸性、中性、碱性化合物均能提供平衡保留，适用于广谱化合物分析。尤其是针对于本品中的吲哚-3-甲醛极性较小的特点，可在有效分离同时确保良好的峰形。
检测方法：分别精确量取对照品溶液、灵敏度溶液、系统适应性溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表1。
表1专属性考察结果
由表1可知，在对照品溶液与系统适应性溶液中，吲哚-3-甲醛保留时间基本一致。图1为吲哚-3-甲醛对照品溶液的HPLC示意图，图2为系统适用性溶液的HPLC示意图；由图1和图2可知，系统适用性溶液中，吲哚-3-甲醛与相邻峰分离度为2.71，分离效果良好，说明本发明的色谱条件可以有效的分离吲哚-3-甲醛。
实施例2：线性及灵敏度实验
对照品贮备液：取吲哚-3-甲醛对照品约3.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
取对照品贮备液分别制成含吲哚-3-甲醛 0.001614μg/mL、0.003227μg/mL、0.008068μg/mL、0.016135μg/mL、0.024203μg/mL、0.048405μg/mL 6种浓度的线性溶液。
一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，色谱条件为：
色谱柱：资生堂MGⅡC18 4.6 mm×250mm，5µm；
流动相：0.02mol/L的磷酸二氢钾（用磷酸调pH值至4.3 ）-乙腈，其中磷酸二氢钾与乙腈的体积比为70：30；
稀释剂：流动相；
波长：306nm；
柱温：35℃；
流速：0.8mL/min；
进样量：100μL；
等度洗脱25min。
检测方法：分别精确量取6个不同浓度的线性溶液和定量限溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表2，线性关系图如图3所示。
表2线性及灵敏度考察结果
由表2可知，线性方程相关系数r达到0.9998，线性关系良好。吲哚-3-甲醛在定量限浓度时，信噪比大于10。说明在本发明的色谱条件下吲哚-3-甲醛灵敏度较高。
实施例3：精密度实验
对照品贮备液：取吲哚-3-甲醛对照品约3.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
50%供试品加标溶液：精密量取本品5ml、对照品贮备液0.5ml，置同一10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行制备3份。
100%供试品加标溶液：精密量取本品5ml、对照品贮备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行制备6份。
150%供试品加标溶液：精密量取本品5ml、对照品贮备液1.5ml，置同一10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。平行制备3份。
一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法， 色谱条件为：
色谱柱：资生堂MGⅡC18 4.6 mm×250mm，5µm；
流动相：0.02mol/L的磷酸二氢钾（用磷酸调pH值至4.3 ）-乙腈，其中磷酸二氢钾与乙腈的体积比为70：30；
稀释剂：流动相；
波长：306nm；
柱温：35℃；
流速：0.8mL/min；
进样量：100μL；
等度洗脱25min。
检测方法：分别精确量取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，结果见表3。
表3精密度考察结果
由表3可知，12份供试品加标溶液吲哚-3-甲醛平均回收率为93.2%，RSD=0.8%，方法准确度良好。说明在本发明的色谱条件下吲哚-3-甲醛的精密度良好。
实施例4：耐用性实验
对照品贮备液：取吲哚-3-甲醛对照品约3.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置20ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密量取本品5ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品加标溶液：精密量取本品5ml、对照品贮备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
一种复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛的检测方法，色谱条件为：
色谱柱：资生堂MGⅡC18 4.6 mm×250mm，5µm；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾（用磷酸调pH值至4.3）-乙腈（70：30）；
稀释剂：流动相；
波长：306nm；
柱温：35℃；
流速：0.8mL/min；
进样量：100μL；
等度洗脱25min。
通过改变流动相比例（磷酸二氢钾与乙腈的体积比）和pH、柱温、流速和波长来考察吲哚-3-甲醛耐用性，动相比例和pH、柱温、流速和波长设定条件如下表4。
表4耐用性条件参数
检测方法：根据表4耐用性条件参数进行设置，精准量取对照品溶液、供试品溶液和供试品加标溶液在进行高效液相色谱仪中进行检测，结果见表5。
表5耐用性考察结果
由表5可知，微调色谱条件后，供试品加标溶液回收率均在90%-110%，吲哚-3-甲醛的RSD=4.1%。说明在本发明的色谱条件下吲哚-3-甲醛方法耐用性良好。
从实施例4的考察结果可知：
在流动相比例考察中，流动相乙腈和体积比为65：35和75：25回收率均无异常，分离度与正常条件基本一致。结合流动相比例耐用性筛选结果，故选择流动相比例范围为65-75:25-35。
在流动相pH考察中，PH值为4.1和4.5时回收率均无异常，分离度与正常条件基本一致。结合流动相pH耐用性筛选结果，故选择流动相中磷酸盐缓冲溶液pH范围为4.1-4.5。可以知道的是，不同pH范围影响化合物的保留时间和峰对称性，该pH范围可以保证吲哚-3-甲醛具有良好的峰形和分离效果。另外不同调节剂因极性等不同会影响目标物峰形，而本发明采用磷酸作为pH调节剂，可以保证不影响目标化合物的峰形。
在柱温考察中，柱温30℃和40℃回收率正常。结合柱温耐用性筛选结果，故选择柱温范围为30-40℃。
在流速考察中，流速0.6ml/min和1.0ml/min回收率均无异常，正常条件0.8ml/min回收率良好。结合流速耐用性筛选结果，故选择流速范围为0.6ml/min-1.0ml/min。
在波长考察中，波长301nm和311nm回收率均无异常，正常条件306nm回收率良好。结合波长耐用性筛选结果，故选择波长范围为301-311nm。可以知道的是，不同检测波长影响化合物的紫外吸收，本发明选取的波长可以保证吲哚-3-甲醛有良好的响应的同时还可以降低其他氨基酸的吸收，避免干扰。
综上所述，本利用高效液相色谱法，结合该杂质响应低、极性小的特点，针对性选择流动相比例及pH、流速、柱温、波长、进样量等色谱条件，有效的实现了吲哚-3-甲醛的基线分离（分离度≥1.5），并实现了该杂质准确的定量检测。该检测方法经过系统的方法学验证，具有专属性强、灵敏度高、精密度好、耐用性强等优点，可定性或可定量检测出复方氨基酸注射液中吲哚-3-甲醛，从而提高相关产品的安全性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。