技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一类licoagroside B衍生物及其在逆转M2巨噬细胞极化中的应用。

背景技术

巨噬细胞在行使具体功能时，会在不同的生理状态下和组织微环境中发生极化，根据其执行的生物学功能不同，大致可分为M1和M2型，在多种疾病中发挥着重要作用，包括肿瘤、感染(细菌和病毒)和各类纤维化疾病等。M1主要的功能为激活免疫反应以应对外源抗原的入侵，以及清除机体出现的异常细胞。M2则主要介导免疫耐受和损伤修复。

在肿瘤发生与进展过程中，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤微环境中浸润丰富,对肿瘤转移、血管生成、免疫逃逸有重要影响，同时大多数患者肿瘤中TAMs的高密度与其不良预后有密切相关。因此，TAMs靶向治疗是抗肿瘤治疗中的热点策略。在肿瘤微环境中，巨噬细胞根据表型以M2型为主。M2表型可促肿瘤细胞生长，M1表型可抑制肿瘤生长，刺激抗肿瘤免疫反应。因而发现通过抑制肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞，诱导其从M2型向M1型再极化，进而提高巨噬细胞对肿瘤细胞的抑制作用的药物，是研制肿瘤免疫药物的一个重要方向。另外在非肿瘤疾病中，M2型巨噬细胞在发生疾病的脏器中的浸润也是许多器官损伤导致纤维化的重要原因，如肺、肝或者肾脏终末期纤维化。因此逆转M2型巨噬细胞增多也是改善纤维化疾病的重要手段之一。再者，逆转M2，增加M1型巨噬细胞，也是增强免疫从而对抗细菌、病毒、支原体等感染性疾病的重要手段。

山豆根取自豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gapnea.)的干燥根和根茎。《开宝本草》记载山豆根有“解诸药毒，止痛，消疮肿毒，急黄发热咳嗽，杀小虫”的作用。《本草求真》中则称山豆根为“专泻心保肺，及降阴经火逆，解咽喉肿痛第一要药。”由此普遍认为山豆根具有清热解毒、消肿利咽的功效，是一种用于治疗咽喉肿痛、牙龈肿胀、肝炎和癌症等疾病的中药。根据文献报道，目前已从山豆根中发现了200多个天然产物，主要成分为生物碱和黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、肝保护和抗病毒等生物活性。

本专利从山豆根中分离得到了一类结构新颖的licoagroside B衍生物。经药理学实验证明其可抑制M2型巨噬细胞极化，促进向M1型巨噬细胞极化，即可诱导肿瘤微环境中的巨噬细胞使其从M2型向M1型再极化，从而提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力。目前，尚未见licoagroside B衍生物逆转M2型巨噬细胞极化的研究报道。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一类新的licoagroside B衍生物，及其制备方法、药物组合物，通过逆转M2型巨噬细胞极化，促进巨噬细胞的吞噬，从而发挥抗肿瘤细胞生长、抗纤维化疾病、抗病毒、抗菌、抗感染等作用和在制备治疗上述疾病药物中的应用。

从山豆根中发现存在一系列licoagroside B衍生物，该类化合物均具有licoagroside B的结构，即麦芽酚苷与3-甲基-3羟基戊二酸成酯。3-甲基-3羟基戊二酸的另一侧羧酸与黄酮苷、木脂素苷等中的葡萄糖成酯，形成双苷酯的结构。

本发明技术方案的第一方面是提供了一种式(Ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中R₁独立的选自黄酮类及其苷，异黄酮类及其苷，苯丙素类及其苷，木脂素类及其苷、紫罗兰醇类及其苷；R₂独立的选自H，芹糖；独立的选自

优选的，其中R₁具有式II的片段,

母核I可独立的连接在式II的A₁、A₂或A₃位；其中A₁、A₂和A₃独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖。

或者，优选的，R₁具有式III的片段,

母核I可独立的连接在式III的B₁、B₂、B₃或B₄位；B₁、B₂、B₃和B₄独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖。

或者，优选的，R₁具有式IV的片段,

母核I可独立的连接在式IV的C₁或C₂位；C₁和C₂独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖；独立的选自

或者，优选的，R₁具有式V的片段,

母核I可独立的连接在式V的D₁、D₂、D₃或D₄位；D₁、D₂、D₃和D₄独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖；独立的选自

或者，优选的，R₁具有式VI的片段,

母核I可独立的连接在式VI的E₁、E₂、E₃或E₄位；E₁、E₂、E₃和E₄独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖；独立的选自

或者，优选的，R₁具有式VII的片段,

母核I可独立的连接在式VII的F₁、F₂、F₃或F₄位；F₁、F₂、F₃和F₄独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖；独立的选自

或者，优选的，R₁具有式VIII的片段,

母核I可独立的连接在式VIII的G₁、G₂、G₃或G₄位；G₁、G₂、G₃和G₄独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基或单糖，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖；独立的选自

或者，优选的，R₁具有式IX的片段,

母核I可独立的连接在式IX的K₁、K₂或K₃位；K₁、K₂和K₃独立的选自H、OH、C₁～C₃的烷氧基，其中烷氧基优选自直链或支链的烷氧基，进一步的优选自OCH₃或OC₂H₅，单糖优选自葡萄糖、木糖或芹糖。

进一步的，所述化合物选自：

上述化合物药学上可接受的盐选自化合物和有机碱、无机碱形成的盐。所述的有机碱包括葡甲胺、三羟甲基氨基甲烷和N-甲基-葡萄糖胺、甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、丙胺、丁胺、辛胺、己二胺、乙二胺、丙二胺、丁二胺、苯甲胺、苯乙胺、邻苯二甲胺、对苯二甲胺，所述的无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铁、氢氧化铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾。

本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其制备方法如下：山豆根药材粉碎，加入溶剂提取。提取液浓缩后，经有机溶剂萃取和柱色谱分离得到上述化合物。

所述的提取溶剂包括水、乙醇以及任意浓度的乙醇水溶液。

所述的萃取溶剂为与水不互溶的有机溶剂或任意比例的混合溶剂。有机溶剂包括但不限于正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷。混合溶剂包括但不限于上述任意比例的两种或多种有机溶剂的混合液以及上述溶剂与甲醇、乙醇、丙酮等溶剂的任意比例的两种或多种有机溶剂的混合液。

所述柱色谱包括常压柱色谱、中压柱色谱以及高效液相柱色谱。使用的填料包括正相填料、反相填料、凝胶填料和离子交换树脂。所述正相填料包括硅胶、二醇、氰基、氨基等填料；反相填料包括大孔树脂、微孔树脂、C18、C8、苯基等填料；凝胶填料包括HW型凝胶，Sephadex型凝胶。

本发明技术方案的第三方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括本发明第一方面所述有效剂量的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。所述的药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、滴丸剂、口服液或混悬剂。所述的药物组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羚甲基纤维素钠、甲基纤维素、轻丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯叱咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代轻丙基纤维素、交联聚乙烯叱咯烷酮、交联羚甲基纤维素钠、羚甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橡酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酷、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的,增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明技术方案的第四方面是提供本发明第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤、抗纤维化疾病、抗病毒、抗菌、抗感染等疾病中的应用。所描述的可以治疗的疾病包括肿瘤、器官纤维化、各类感染(包括病毒，细菌与支原体)等。

有益技术效果：

本发明从山豆根发现的一类结构新颖的licoagroside B衍生物，具有显著的抑制M2型巨噬细胞极化的作用，能够促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬，从而发挥抗肿瘤的治疗作用。逆转M2巨噬细胞极化作用，还与各类器官纤维化，抗感染的作用相关，因而该类成分具有进一步开发成抗肿瘤、抗纤维化疾病、抗病毒、抗菌、抗感染药物的应用前景。

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例山豆根中licoagroside B衍生物的制备

山豆根药材(50kg)粉碎，分别加入蒸馏水回流提取3次，每次2h。提取液浓缩，经大孔树脂柱色谱，用乙醇(0-95％)依次洗脱。30％乙醇洗脱部分浓缩后，经MCI柱，依次用乙醇(0-75％)洗脱。其中10％、20％乙醇部分经硅胶(60-100目)柱，用氯仿-甲醇(99:1-1:1)梯度洗脱，得到Fr.1-41和Fr.G-1-32。将Fr.18-24和Fr.G-11-18合并,经Diol Flash柱(CHCl₃-MeOH,20:1-2:1)洗脱得到M7-D1-26。

1)流份M7-D4-6经Diol Flash柱(EtOAc-MeOH,30:1-5:1)洗脱得到Fr.D-1-22。

流份Fr.D-5经Toyopearl HW-40F柱(MeOH-H₂O,90％)，得到3个组份Fr.D-5-1～3。Fr.D-5-1经半制备型PFP色谱柱(2.5mL/min,50％甲醇，波长205nm)，得到化合物7(t_R＝20.5min)和8(t_R＝26.0min)；Fr.D-5-2经半制备型PFP色谱柱(2.5mL/min，波长205nm)，得到化合物6(60％甲醇,t_R＝12.5min)，9(49％甲醇,t_R＝27.0min)。流份Fr.D-6过C18 Flash柱(MeOH-H2O,20-60％)洗脱，得到3个组分。组分1使用半制备型MG-Ⅱ色谱柱(2.5mL/min，50％甲醇,波长205nm)，得到化合物4(t_R＝20.5min)；组分2使用半制备型PFP色谱柱(2.5mL/min,波长205nm)，得到化合物1(60％甲醇,t_R＝17.5min)，2(58％甲醇,t_R＝25.0min)，5(60％甲醇,t_R＝14.0min)；组分3使用半制备C₈色谱柱(2.5mL/min,波长205nm)，得到化合物10(40％甲醇,t_R＝45.0min)和11(40％甲醇,t_R＝46.3min)。

流份Fr.D-7使用半制备型PFP色谱柱(2.5mL/min，54％甲醇，波长205nm)，得到化合物3(t_R＝31.0min)。

流份Fr.D-8使用半制备型PFP色谱柱(2.5mL/min，40％甲醇，波长205nm)，得到13(t_R＝50.0min)。

2)从流份M7-D7中，使用PFP半制备色谱柱(2.5mL/min，49％甲醇，波长205nm)，得到化合物12(t_R＝21.2min)。

3)从流份M7-D9中，使用半制备C₈色谱柱(35％甲醇，2.5ml/min，波长205nm)，得到化合物14(t_R＝49.8min)，15(t_R＝49.2min)。

化合物结构经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段确定。

上述新化合物的波谱信息及核磁信号归属如下：

化合物1麦芽酚[5”-O-6””'-(4””,7”'-二羟基-3””-甲氧基黄酮-4””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)215(-3.41),318(-0.80)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)208(4.47),235(4.17),328(4.06)nm；IRν_max3366,2923,2852,1731,1627,1601,1508,1454,1381,1254,1073cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z 859.2313[M-H]^-(calcd for C₄₀H₄₃O₂₁ ^-,859.2302)。

化合物2麦芽酚[5”-O-6””'-(熊竹素B-4””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)215(-12.44),282(-3.86)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)205(4.84),255(4.52),314(4.59)nm；IRν_max3381,2926,1731,1626,1608,1508,1381,1251,1073,845cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z 829.2203[M-H]^-(calcd for C₃₉H₄₁O₂₀ ^-,829.2197)。

化合物3麦芽酚[5”-O-6””'-(熊竹素B-7”'-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)203(-8.51),288(-2.18)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)205(4.76),230(4.45),255(4.35),309(4.34),327(4.39)nm；IRν_max 3376,2923,1731,1625,1608,1446,1379,1073cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z 829.2204[M-H]^-(calcd for C₃₉H₄₁O₂₀ ^-,829.2197)。

化合物4麦芽酚[5”-O-6””'-(7”',4””-二羟基-8”'-甲氧基异黄酮-4””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)231(-7.06)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.79),253(4.74)nm；IRν_max 3381,2925,2854,1731,1644,1608,1510,1451,1253,1074cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z 859.2308[M-H]^-(calcd for C₄₀H₄₃O₂₁ ^-,859.2302)。

化合物5麦芽酚[5”-O-6””'-(毛蕊花素-3””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)227(-14.61),283(-3.07)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)205(4.72),252(4.66),303(4.19)nm；IRν_max3390,2924,1731,1644,1623,1515,1457,1265,1199,1073,849cm^-1；¹H NMR和¹³CNMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z 859.2308[M-H]^-(calcd for C₄₀H₄₃O₂₁ ^-,859.2302)。

化合物6麦芽酚[5”-O-6””'-(7”',3””-二羟基-8”',4””-二甲氧基异黄酮-3””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)224(-12.71),287(-2.39)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)205(4.77),255(4.66)nm；IRν_max 3379,2921,2856,1731,1644,1608,1515,1453,1256,1074cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-1和1-2；(-)-HRESIMS m/z889.2415[M-H]^-(calcd for C₄₁H₄₅O₂₂ ^-,889.2408)。

化合物8(6”'S,9”'S)-麦芽酚[5”-O-6””-曲霉苷I-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)242(+19.83),292(-1.78)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)242(4.33)nm；IRν_max 3374,2925,2854,1731,1647,1609,1254,1198,1070cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-3；(-)-HRESIMS m/z 931.3440[M-H]^-(calcdfor C₄₂H₅₉O₂₃ ^-,931.3453)。

化合物9(8”'R,8””R)-麦芽酚[5”-O-6””'-(开环异落叶松树脂酚-4”'-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)226(-9.57),273(-4.03)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)202(5.08),261(4.17)nm；IRν_max 3361,2920,2852,1732,1645,1602,1515,1258,1073cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-4和1-5；(-)-HRESIMS m/z937.3353[M-H]^-(calcd for C₄₄H₅₇O₂₂ ^-,937.3347)。

化合物10(7”'R,8”'S)-麦芽酚[5”-O-6””'-(去氢二松柏醇-4”'-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)217(-6.01),281(-6.33)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.77),220(4.52),268(4.22)nm；IRν_max3381,2924,1731,1645,1603,1258,1073,1032cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-4和1-5；(-)-HRESIMS m/z979.3093[M+HCOO]^-(calcd for C₄₅H₅₅O₂₄ ^-,979.3089)。

化合物11(8”'R,7””S,8””R)-麦芽酚[5”-O-6””'-(落叶松树脂醇-4””-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)220(-27.28),275(-10.47)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)206(5.44),259(4.70)nm；IRν_max 3391,2927,1732,1645,1608,1515,1258,1073,1032cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-4和1-5；(+)-HRESIMS m/z937.3334[M+H]⁺(calcd for C₄₄H₅₇O₂₂ ⁺,937.3336)。

化合物12(7”'R,8”'S,7””R,8””S)-麦芽酚[5”-O-6””'-(松脂醇-4”',4””-二-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)203(-10.50),276(-1.67)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)202(4.92),228(4.28),261(3.92)nm；IRν_max3397,2923,1732,1645,1607,1513,1258,1074cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR见表1-4和1-5；(+)-HRESIMS m/z1097.3716[M+H]⁺(calcd for C₅₀H₆₅O₂₇ ⁺,1097.3708)。

化合物13麦芽酚[5”-O-6””-(E)-松柏苷-6'-O-(3”-羟基-3”-甲基戊二酰)]-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

淡黄色粉末；ECD(MeOH)λ_max(Δε)217(-6.36),261(-2.63)nm；UV(MeOH)λ_max(logε)212(4.42),257(4.31),298(3.62)nm；IRν_max3381,2922,1732,1645,1608,1512,1256,1199,1073,1023cm^-1；¹H NMR和¹³CNMR见表1-4和1-5；(+)-HRESIMSm/z 779.2367[M+Na]⁺(calcd for C₃₄H₄₄O₁₉Na⁺,779.2369)。

化合物14

白色粉末；¹H NMR和¹³C NMR见表1-6。

化合物15

白色粉末；¹H NMR和¹³C NMR见表1-6。

表1-1化合物1-6的¹H NMR数据(CD₃OD)

在^a500 MHz，^b400 MHz.下测定；^c,d信号可相互交换

表1-2化合物1-6的¹³C NMR(126MHz)数据(CD₃OD)

表1-3化合物8的¹H NMR和¹³C NMR数据(CD₃OD)

¹H谱在^a500 MHz下测定；¹³C谱在^b126 MHz下测定；^c,d信号可互换；通过^e HMBC谱中归属；

^f与溶剂峰重叠，通过HSQC谱归属.

表1-4化合物9-13的¹H NMR数据(CD₃OD)

在^a500 MHz,^b400 MHz,^c600 MHz下测定；^d,g,h,I,k信号可互换；^e与水峰重叠

表1-5化合物9-13的¹³C NMR数据(CD₃OD)

在^a101 MHz,^b126 MHz,^c151 MHz下测定；^e-k,m,n,p-s信号可互换.

表1-6化合物14和15的¹H NMR(700Hz)和¹³C NMR(151Hz)数据(CD₃OD)

药理实验

效果例1对M2型巨噬细胞的抑制作用

将小鼠巨噬细胞Ana-1培养于10％ FBS的1640培养基并铺于6孔板，待测样品以10μM的浓度与细胞预孵育2h，以20ng/mL的IL-4诱导Ana-1细胞向M2型极化，共孵育24h。收取细胞离心，将细胞以100μL重悬，每组细胞先以CD16/32封闭非特异性结合位点后，加入APC-CD206抗体，避光条件下孵育30min，PBS清洗后用流式细胞术测定M2型巨噬细胞比例。结果(表2-1)显示，5个化合物(1,4,5,9,11)在10.0μM浓度下具有减少M2型巨噬细胞占比的作用。

表2-1化合物(10.0μM)对M2型巨噬细胞的抑制作用

**P＜0.01,与模型组比较

效果例2抑制M2型巨噬细胞极化作用的剂量依赖性

为研究活性化合物的剂量依赖性，进一步测定其中4个活性化合物在不同浓度(1μM,2.5μM,10μM)下的活性。将小鼠巨噬细胞Ana-1培养于10％FBS的1640培养基并铺于6孔板，待测样品分别以1,2.5,10μM的浓度与细胞预孵育2h，以20ng/mL的IL-4诱导Ana-1细胞M2型极化，共孵育24h。收取细胞离心，将细胞以100μL重悬，每组细胞先以CD16/32封闭非特异性结合位点后，加入APC-CD206抗体，避光条件下孵育30min，PBS清洗后用流式细胞术测定M2型巨噬细胞比例。结果如表2-2所示。

表2-2不同浓度化合物对M2型巨噬细胞的抑制作用

*P＜0.05,**P＜0.01,与模型组比较

效果例3对肿瘤细胞的吞噬作用

从小鼠后腿股骨中分离骨髓细胞，使用CSF1诱导为原代巨噬细胞，将巨噬细胞与CFSE染料标记后的肿瘤细胞进行共培养，在37℃下处理2h后，用APC偶联的F4/80对巨噬细胞进行染色，并进行流式细胞术分析。每个样本中总共分析了10,000个细胞。准备未染色的对照和单染细胞用于设门。吞噬作用计算方法为F4/80+CFSE+细胞在F4/80+细胞中的百分比。

表2-3巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用

*P＜0.05,**P＜0.01,与对照组比较

由效果例1和2中可知，从山豆根中得到的licoagroside B衍生物(1,4,5,9,11)表现出强弱不等的抑制M2型巨噬细胞的作用。其中化合物1活性最强，在1.0μM具有显著的逆转作用，但剂量依赖性一般；化合物5在1.0μM具有显著作用，在2.5μM和10.0μM表现出剂量依赖；化合物9在2.5μM和10.0μM表现出剂量依赖，但1.0μM无效；化合物11在1.0μM具有显著作用，并在1.0μM和2.5μM表现出剂量依赖。

由效果例3可知：化合物(5,9,11)在不同浓度下对巨噬细胞的吞噬有促进作用，其中化合物5,11在2.0μM浓度下，即有显著活性。

以上说明此类化合物有显著逆转M2巨噬细胞极化，从而促进巨噬细胞吞噬，具有开发为抗肿瘤、抗纤维化疾病、抗病毒、抗菌、抗感染等相关疾病药物的前景。